本發明屬于epa-ee的制備領域，尤其涉及一種從魚油中制備高純度epa-ee的方法。
背景技術：
魚油，英文名稱為fatsandglyceridicoils，cas號為8016-13-5，是魚體內的全部油類物質的總稱，來源于大型海洋魚類的身體，其主要成分為omega-3脂肪酸，包括dha、epa、ara等，是一種多元不飽和脂肪酸。
epa是eicosapentaenoicacid即二十碳五烯酸的英文縮寫，是人體不可缺少的重要營養素，具有降低膽固醇和甘油三酯的含量，促進體內飽和脂肪酸代謝的作用，防止脂肪在血管壁的沉積，預防動脈粥樣硬化的形成和發展、預防腦血栓、腦溢血、高血壓等心血管疾病。雖然亞麻酸在人體內可以轉化為epa，但此反應在人體中的速度很慢且轉化量很少，遠遠不能滿足人體對epa的需要，因此必須從食物中直接補充。
高純度的二十碳五烯酸乙酯(epa-ee)可以作為原料藥，應用于醫藥領域。美國amarin公司研制的用于治療高甘油三酯血癥和血脂異常癥的藥物，就是采用純度大于96％的二十碳五烯酸乙酯(epa-ee)，目前已進入三期臨床，將成為美國唯一治療高甘油三酯血癥和血脂異常癥的omega-3(ω-3)脂肪酸處方藥。因此，高純度二十碳五烯酸乙酯(epa-ee)未來必將廣泛的應用于原料藥和醫藥中間體。
目前，已報道的從魚油制備二十碳五烯酸乙酯(epa-ee)的方法很多，主要包括以下幾種：尿素包合法、低溫冷凍法、金屬鹽沉淀法、真空蒸餾法、超臨界萃取法、高效液相色譜法、柱層析法等。這些方法都各有優缺點，但大部分方法還是停留在簡單地去除魚油中色素、膽固醇和部分飽和脂肪酸的水平，無法制備得到高純度二十碳五烯酸乙酯(epa-ee)或者制備得到的產品不達標，無法應用。采用制備色譜可以制備得到高純度二十碳五烯酸乙酯(epa-ee)，但是處理量小且需要特殊設備，成本高，很難實現工業化生產。因此研究開發簡單可控、容易操作、成本低廉、可實現工業化生產的制備高純度二十碳五烯酸乙酯(epa-ee)的方法勢在必行。
技術實現要素：
為了實現高純度二十碳五烯酸乙酯(epa-ee)的工業化生產，本發明提供一種從魚油中制備高純度epa-ee的方法，本方法同時利用了分子蒸餾、柱層析、銀離子絡合三種方法來提高產品的純度，除去產品里的有害雜質。
本發明的技術解決方案是提供一種從魚油中制備高純度epa-ee的方法，包括以下步驟：
1)通過二級分子蒸餾方法蒸餾乙酯化的粗魚油，得到epa-ee、dha-ee、ara-ee的混合物；
2)將步驟1)分子蒸餾得到的產品通過柱層析純化，制備得到epa-ee粗產品，所述epa-ee粗產品含極少的dha-ee、ara-ee或不含dha-ee、ara-ee；
3)將柱層析純化后的粗epa-ee通過硝酸銀絡合法純化，利用溫度差異除雜，
得到epa-ee產品。
優選地，上述步驟1)具體為：
設置一級分子蒸餾蒸發面溫度為90-120℃，冷凝面溫度為10-35℃，進料保溫溫度為35-60℃，掛膜轉速為200-250轉/分鐘，進料速度為3-7l/min，壓力為10-20pa，進行一級分子蒸餾，棄去餾分；
設置二級分子蒸餾蒸發面溫度為120-140℃，冷凝面溫度為10-35℃，進料保溫溫度為35-60℃，掛膜轉速為200-250轉/分鐘，進料速度為3-7l/min，壓力為5-15pa，進行二級分子蒸餾，收集餾分用于步驟2)中。
更進一步地，上述步驟1)具體為：
設置一級分子蒸餾蒸發面溫度為120℃，冷凝面溫度為25℃，進料保溫溫度為45℃，掛膜轉速為230轉/分鐘，進料速度為5l/min，壓力為15pa，進行一級分子蒸餾，棄去餾分；
設置二級分子蒸餾蒸發面溫度為140℃，冷凝面溫度為20℃，進料保溫溫度為45℃，為掛膜轉速230轉/分鐘，進料速度為5l/min，壓力為5pa，進行二級分子蒸餾，收集餾分用于步驟2)中。
優選地，上述步驟2)具體為：
將步驟1)得到的產品加入反相硅膠柱，使用甲醇水或者乙醇水體系作為洗脫劑洗脫。
優選地，上述反相硅膠柱為c-18反相硅膠柱；所述反相硅膠柱高徑比為20-30。
上述步驟2)也可以具體為：
將步驟1)得到的產品加入正相硅膠柱，使用石油醚、己烷、乙酸乙酯、丙酮體系作為洗脫劑洗脫。
優選地，上述正相硅膠柱的高徑比為20-30。
優選地，上述步驟3)具體為：將步驟2)柱層析后的粗epa-ee加入到50-60％硝酸銀水溶液中，其中硝酸銀水溶液的質量為粗epa-ee質量的3-8倍，用環己烷低溫萃取，其中環己烷的質量為粗epa-ee質量的3-5倍，分取環己烷相，作為副產物；水相再用3-5倍量的環己烷高溫萃取兩次，然后迅速降溫，分取并合并兩次環己烷相；向環己烷相中加入硅膠，過濾，除掉溶液中的銀離子，濃縮濾液，既得最終產品epa-ee。
優選地，上述步驟3)具體為：將步驟2)柱層析后的粗epa-ee加入到50-60％硝酸銀水溶液中，其中硝酸銀水溶液的質量為粗epa-ee質量的5倍，用環己烷在0-15℃萃取1-2分鐘，其中環己烷質量為粗epa-ee質量的4倍，分取環己烷相，作為副產物；水相再用4倍量的環己烷50-70℃萃取兩次，每次10-15分鐘，然后迅速降溫至20-30℃，分取并合并兩次環己烷相；向環己烷相中加入原料一半量的硅膠，過濾，除掉溶液中的銀離子，濃縮濾液，既得最終產品epa-ee。
本發明的優點是：
本發明依次通過分子蒸餾、柱層析、銀離子絡合步驟分離提取乙酯化的粗魚油中的epa-ee，最終得到純度為96％以上的產品，操作簡單、成本低廉、可實現工業化生產的制備。
具體實施方式
以下結合具體實施例對本發明做進一步的描述。
實施例一
1、分子蒸餾
取乙酯化的粗魚油5000g，調節分子蒸餾設備參數，一級蒸餾蒸發面溫度90℃，冷凝面溫度10℃，進料保溫溫度35℃，掛膜轉速200轉/分鐘，進料速度3l/min，壓力10pa；二級蒸餾蒸發面溫度120℃，冷凝面溫度10℃，進料保溫溫度35℃，掛膜轉速200轉/分鐘，進料速度3l/min，壓力5pa，收集二級蒸餾產品400g。
2、柱層析純化
取步驟1中得到的產品50g，用65％的甲醇或者乙醇溶解，通過高徑比為25的c-18反相硅膠柱分離純化，收集富含epa-ee部分流出液，回收溶劑，得到epa-ee粗產品23g。
3、硝酸銀絡合法純化
取步驟2得到的epa-ee粗產品20g，加入到60ml55％硝酸銀水溶液中，避光振蕩5分鐘，加入100ml環己烷10℃萃取2分鐘，分取環己烷相，作為副產物，水相再用100ml環己烷60℃萃取兩次，每次10分鐘，然后迅速降溫至20-30℃，分取兩次環己烷相，合并，經10g硅膠過濾除掉溶液中的銀離子，濾液(環己烷相)濃縮，既得10.3g97.2％產品。
實施例二
1、分子蒸餾
取乙酯化的粗魚油5000g，調節分子蒸餾設備參數，一級蒸餾蒸發面溫度120℃，冷凝面溫度25℃，進料保溫溫度45℃，掛膜轉速230轉/分鐘，進料速度5l/min，壓力15pa；二級蒸餾蒸發面溫度140℃，冷凝面溫度20℃，進料保溫溫度45℃，掛膜轉速230轉/分鐘，進料速度5l/min，壓力10pa，收集二級蒸餾產品420g。
2、柱層析純化
取步驟1中得到的產品50g，用70％的甲醇或者乙醇溶解，通過高徑比為25的c-18反相硅膠柱分離純化，收集富含epa-ee部分流出液，回收溶劑，得到epa-ee粗產品25g。
3、硝酸銀絡合法純化
取步驟2得到的epa-ee粗產品20g，加入到100ml55％硝酸銀水溶液中，60ml環己烷0-15℃萃取1分鐘，分取環己烷相，作為副產物，水相再用80ml環己烷60℃萃取兩次，每次10-15分鐘，然后迅速降溫至20-30℃，分取兩次環己烷相，合并，經10g硅膠過濾除掉溶液中的銀離子，濾液(環己烷相)濃縮，既得10.5g96.8％產品。
實施例三
1、分子蒸餾
取乙酯化的粗魚油5000g，調節分子蒸餾設備參數，一級蒸餾蒸發面溫度110℃，冷凝面溫度35℃，進料保溫溫度60℃，掛膜轉速250轉/分鐘，進料速度7l/min，壓力20pa；二級蒸餾蒸發面溫度140℃，冷凝面溫度35℃，進料保溫溫度60℃，掛膜轉速250轉/分鐘，進料速度7l/min，壓力15pa，收集二級蒸餾產品398g。
2、柱層析純化
取步驟1中得到的產品50g，用80％的甲醇或者乙醇溶解，通過高徑比為25的c-18反相硅膠柱分離純化，收集富含epa-ee部分流出液，回收溶劑，得到epa-ee粗產品23.5g。
3、硝酸銀絡合法純化
取步驟2得到的epa-ee粗產品20g，加入到160ml60％硝酸銀水溶液中，80ml環己烷0-15℃萃取1-2分鐘，分取環己烷相，作為副產物，水相再用80ml環己烷60℃萃取兩次，每次10-15分鐘，然后迅速降溫至20-30℃，分取兩次環己烷相，合并，經10g硅膠過濾除掉溶液中的銀離子，濾液(環己烷相)濃縮，既得10.0g98.7％產品。