本發明屬于生物
技術領域：
，尤其涉及一種基于pockitmicro熒光pcr平臺的禽流感病毒h7亞型檢測試劑及應用，本發明還涉及針對禽流感病毒h7亞型的檢測試劑盒及檢測系統。
背景技術：
：禽流感(avianinfluenza)是禽流行性感冒的簡稱，它是由禽流感病毒引起的一種禽類急性傳染病，被國際獸疫局定為甲類傳染病。通常禽流感只在禽類之間感染和傳播，但有時也能感染人類，自1997年香港首次發現人感染禽流感以來，全球多地均報告了人禽流感病例，病死率約60％。雖然禽流感被發現已逾百年，但至今人類并未掌握特異性的預防和治療方法，僅能以消毒、隔離、大量宰殺禽畜的方法防止其蔓延。因此，禽流感目前已成為一個重大的公共安全問題，在給禽類和人類健康帶來嚴重威脅的同時，也給社會造成了巨大的經濟損失。禽流感病毒(aiv)屬于正粘病毒科的甲型流感病毒，多為球形，直徑80～120nm，有囊膜，病毒表面有10～12nm的密集釘狀物或纖突覆蓋，病毒囊膜內有螺旋形核衣殼。禽流感病毒基因組由8個負鏈的單鏈rna片段組成，共編碼10個病毒蛋白。依據其套膜上的血凝素(h)/和神經氨酸酶(n)蛋白抗原性的不同，可分為16個h亞型(h1～h16)和9個n亞型(n1～n9)。在禽類中高致病性禽流感病毒為h5、h7亞型，典型的雞禽流感病毒為h7n7型，人感染禽流感病毒主要為h5n1、h9n2、h7n7型。h7亞型是1955年被發現并確定的禽流感病毒亞型，作為一種高致病性禽流感病毒，近年來，h7亞型病毒的暴發已導致全球超過七千萬家禽的死亡，疫情波及歐洲、亞洲、北美洲、南美洲和大洋洲，由于該亞型病毒多為暴發型且破壞力巨大，因此引發了全球的廣泛關注。雖然目前針對h7亞型的基礎研究已取得了一定的進展，例如已經測定獲得了其ha基因的全部序列以及血凝素基因的部分序列，但我們的研究還有很大的局限，對病毒進化、致病機制、流行規律等仍不甚了解，因此，只有進一步加強在人群和動物中對該亞型禽流感病毒的監測，同時致力于基礎研究和相關疫苗及藥物的研發，才能使我們從容地應對未來可能出現的禽流感疫情。為了實現上述目的，研究開發針對禽流感病毒h7亞型的檢測試劑，并建立操作簡便、快速、敏感性好、特異性強的檢測方法和檢測系統是很有必要的，將其推廣應用于禽流感的早期篩查會對疫情的預防和控制產生積極的影響。技術實現要素：針對上述問題，本發明人研究開發了一種基于pockitmicro熒光pcr平臺的禽流感病毒h7亞型檢測試劑，并在該檢測試劑的基礎上建立了禽流感病毒h7亞型的檢測試劑盒及檢測系統。本發明檢測試劑盒及檢測系統操作簡單、檢測速度快、敏感性好、特異性強、方便易攜帶且檢測成本較低。利用本發明檢測試劑盒及檢測系統可在實驗室、醫院、畜牧場、飼養場、活禽市場等各種場所即時的對禽流感病毒h7亞型進行檢測，并能夠準確、快速的獲得檢測結果。第一方面，本發明提供了一種基于pockitmicro熒光pcr平臺的禽流感病毒h7亞型檢測試劑，所述檢測試劑中包含檢測禽流感病毒h7亞型的特異性引物和探針，其中，所述特異性引物的核苷酸序列如seqidno:1和seqidno:2所示，所述探針的核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示，所述探針的核苷酸序列的5'端連接有熒光報告基團fam標記，3'端連接有非熒光淬滅基團和mgb修飾基團。進一步地，本發明涉及上述檢測試劑在制備禽流感病毒h7亞型檢測試劑盒中的應用。尤其是，本發明還涉及上述檢測試劑在制備禽流感病毒h7n7或h7n9亞型檢測試劑盒中的應用。此外，本發明還涉及上述檢測試劑在制備h7亞型禽流感診斷或治療藥物中的應用。第二方面，本發明提供了一種基于pockitmicro熒光pcr平臺的禽流感病毒h7亞型檢測試劑盒，所述檢測試劑盒中包含標準品和熒光定量pcr反應試劑；所述熒光定量pcr反應試劑包含dntps、taq酶、緩沖液、特異性引物和探針；其中，所述特異性引物的核苷酸序列如seqidno:1和seqidno:2所示，所述探針的核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示，所述探針的核苷酸序列的5'端連接有熒光報告基團fam標記，3'端連接有非熒光淬滅基團和mgb修飾基團。進一步地，上述檢測試劑盒中還包含陽性對照品和/或陰性對照品。優選地，上述檢測試劑盒中的標準品為包含禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的重組質粒。優選地，上述檢測試劑盒中的熒光定量pcr反應試劑為冷凍干燥粉，該檢測試劑盒中還包含ddh2o。利用冷凍干燥技術將熒光定量pcr反應試劑制成冷凍干燥粉，可有效延長其保質期，所述熒光定量pcr反應試劑冷凍干燥粉在4℃條件下的保質期可達2年，且短途運輸過程中無需冷鏈。第三方面，本發明提供了一種基于pockitmicro熒光pcr平臺的禽流感病毒h7亞型檢測系統，所述檢測系統中包含核酸萃取試劑盒、檢測試劑盒、pockitmicro熒光pcr核酸分析儀、微型離心機和移動電源；所述檢測試劑盒中包含標準品和熒光定量pcr反應試劑；所述熒光定量pcr反應試劑包含dntps、taq酶、緩沖液、特異性引物和探針；其中，所述特異性引物的核苷酸序列如seqidno:1和seqidno:2所示，所述探針的核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示，所述探針的核苷酸序列的5'端連接有熒光報告基團fam標記，3'端連接有非熒光淬滅基團和mgb修飾基團。優選地，上述檢測系統，其中所述檢測試劑盒中包含的標準品為包含禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的重組質粒；所述熒光定量pcr反應試劑為冷凍干燥粉，所述檢測試劑盒中還包含ddh2o。本發明檢測試劑盒和檢測系統由于具有檢測結果準確、操作簡單、方便易攜、節省試劑、無需電泳、現場快速檢測等優點，可將其推廣應用于禽流感的早期篩查和診斷，必定會對禽流感疫情的預防和控制產生積極的影響。具體實施方式以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發明的精神下進行各種修飾或改變。在進一步描述本發明具體實施方式之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和科學術語與本
技術領域：
技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本
技術領域：
的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如j.sambrook等著，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照實驗器材制造廠商所建議的條件。實施例1禽流感病毒h7亞型檢測試劑盒1本檢測試劑盒中包含標準品和熒光定量pcr反應試劑。其中，標準品為包含禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的重組質粒。熒光定量pcr反應試劑包含dntps、taq酶、緩沖液、特異性引物和探針，特異性引物和探針的核苷酸序列如下表1所示。表1特異性引物和探針的核苷酸序列實施例2禽流感病毒h7亞型檢測試劑盒2本檢測試劑盒中包含標準品、熒光定量pcr反應試劑冷凍干燥粉、ddh2o、陽性對照品和陰性對照品。其中，標準品為包含禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的重組質粒。熒光定量pcr反應試劑冷凍干燥粉包含dntps、taq酶、緩沖鹽、特異性引物和探針，特異性引物和探針的核苷酸序列如上表1所示。陽性對照品為含有禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的dna樣品，陰性對照品為不含有ha基因或該基因片段的dna樣品。實施例3禽流感病毒h7亞型檢測系統本檢測系統中包含核酸萃取試劑盒、檢測試劑盒、pockitmicro熒光pcr核酸分析儀、微型離心機和移動電源。檢測試劑盒中包含標準品和熒光定量pcr反應試劑。其中，標準品為包含禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的重組質粒。熒光定量pcr反應試劑包含dntps、taq酶、緩沖液、特異性引物和探針，特異性引物和探針的核苷酸序列如上表1所示。實施例4禽流感病毒h7亞型檢測一、檢測對象經實驗室pcr方法確診的感染h7亞型禽流感病毒的家禽咽喉拭子為檢測樣本，未感染h7亞型禽流感病毒的家禽咽喉拭子作為陰性對照樣本。二、樣品核酸提取實驗試劑：使用petnad核酸萃取試劑盒(金瑞鴻捷生物科技有限公司)，應用純化管柱萃取系統。萃取試劑盒產品組成如下表2所示。表2萃取試劑盒產品組成品名體積注意事項：初次使用前pb136ml/瓶-pb21ml/瓶使用前加入35ml95％酒精pb320ml/瓶使用前加入20ml95％酒精pb415ml/瓶使用前加入25ml95％酒精pb512ml/瓶-純化管柱&收集管50組/袋-實驗儀器：cubee微型離心機(瑞基海洋生物科技股份有限公司)。提取方法：按照petnad核酸萃取試劑盒使用說明書，提取樣品基因組dna，操作步驟如下：1、樣本的處理分別將檢測樣本和陰性對照樣本的咽喉拭子放置在含有1mldepc水或是生理鹽水中充分震蕩混合，丟棄拭子，置于微型離心機中先離心數秒，取200μl上清液備用。2、核酸提取(1)取600μlpb1加入上述離心管中，將離心管蓋上蓋子后，迅速地上下搖動1分鐘；(2)再加入600μlpb2(含酒精)，將離心管蓋上蓋子后，迅速地上下搖動10秒；(3)取600μl的混合溶液，加到純化管柱中；(4)離心1分鐘后，倒掉收集管內液體；(5)加入600μlpb3(含酒精)到純化管柱中；(6)離心1分鐘，倒掉收集管內液體；(7)加入600μlpb4(含酒精)到純化管柱中；(8)離心1分鐘，倒掉收集管內液體；(9)再離心3分鐘，除去殘留乙醇；(10)丟掉收集管，將純化管柱套至新的離心管上；(11)在純化管柱中加入50μl的pb5，放置在室溫下1分鐘；(12)離心1分鐘后，丟棄純化管柱，所得核酸萃取物可以立即使用，或存放在4℃下1小時內用完。三、pcr檢測采用絕熱恒溫聚合酶鏈反應(iipcr)技術，在特殊設計的毛細管針對單點進行恒溫加熱，然后利用熒光檢測系統對樣品核酸進行檢測分析，并在45分鐘內獲得檢測結果。實驗儀器：pockitmicro熒光pcr核酸分析儀(瑞基海洋生物科技股份有限公司)。目的基因：禽流感病毒h7亞型ha基因。標準品：包含禽流感病毒h7亞型ha基因或該基因片段的重組質粒。iipcr反應體系如下表3所示。表3iipcr反應體系體系成分濃度(終濃度)體積(μl)dntp25mm(0.5mm)1凍干buffer-6.3引物110μm(0.5μm)2.5引物210μm(0.5μm)2.5探針15μm(0.05μm)0.5探針25μm(0.05μm)0.5iipcrmmlvrtase4u/μl(8u)2.00rnaseinhibitor2u/μl(2u)1.00noglyceroltaq35unit/μl(26.25u)0.75ddh2o-加至50μl引物與探針：引物1序列：5'-gcttcggggcatcatgtt-3'(seqidno:1)；引物2序列：5'-gcaccgcatgtttccattctt-3'(seqidno:2)；探針1序列：5'-attgcaatgggccttgtc-3'(seqidno:3)；探針2序列：5'-attgcaatgggattggtt-3'(seqidno:4)。檢測步驟：1、標準品制備初次使用干燥標準品先用100μl標準品回溶液回溶，回溶后的標準品溶液在4℃條件下保存。2、樣本檢測(1)按照上表3所示的體系組成制備iipcr反應液；(2)向三個裝有上述iipcr反應液的pcr反應管中分別加入5μl檢測樣本核酸萃取物、陰性對照樣本核酸萃取物和標準品溶液，利用移液器反復吹吸混合均勻；(3)分別吸取50μl上述混合物移入r-tubetm；(4)將r-tubetm蓋上蓋子后，利用微型離心機將r-tubetm里的液體離心至管底；(5)啟動檢測儀，待檢測儀完成自檢后將r-tubetm放入反應槽中；(6)蓋上機器蓋子后，開機啟動擴增程序并完成核酸檢測，結果將于反應完成后顯示在lcd面板上。四、檢測結果結果顯示：檢測樣本核酸萃取物和標準品溶液檢測結果均為“+”(陽性)，陰性對照樣本核酸萃取物檢測結果為“－”(陰性)，說明利用本檢測系統可對h7亞型禽流感病毒進行快速檢測，檢測結果準確，特異性好。實施例5禽流感病毒h7亞型檢測系統靈敏度測試一、檢測對象將實施例4中包含禽流感病毒h7亞型ha基因片段的重組質粒進行測序，測序結果正確的質粒采用nanodrop2000精確定量，然后根據質粒分子量計算摩爾量，制備出100、33、10和0拷貝/μl的標準品用于靈敏度測試。二、檢測方法iipcr反應體系與檢測方法同實施例4。三、測試結果測試結果如下表4所示。表4禽流感病毒h7亞型檢測系統靈敏度測試拷貝數(μl)重現性means/nsd1004/43.850.13334/43.440.45104/43.540.4400/41.010.04結果顯示：本檢測系統檢測靈敏度可達到10拷貝(4/4)。以上對本發明優選的具體實施方式和實施例作了詳細說明，但是本發明并不限于上述實施方式和實施例，在本領域技術人員所具備的知識范圍內，還可以在不脫離本發明構思的前提下作出各種變化。sequencelisting<110>金瑞鴻捷（廈門）生物科技有限公司、北京華安瑞基生物科技有限公司<120>基于pockitmicro熒光pcr平臺的禽流感病毒h7亞型檢測試劑及應用<130>2017<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1gcttcggggcatcatgtt18<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2gcaccgcatgtttccattctt21<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3attgcaatgggccttgtc18<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<400>4attgcaatgggattggtt18當前第1頁12