編碼組織型纖溶酶原激活劑的DNA分子及其重組細胞株的制作方法

本發明屬于生物技術領域，涉及編碼組織型纖溶酶原激活劑的dna分子，本發明還涉及包含該dna分子的載體以及其重組細胞株。

背景技術：

組織型纖溶酶原激活劑(tissue-typeplaminogenactivator，tpa)由血管內皮細胞合成并分泌的一種糖蛋白，是血液內纖溶系統的生理性激活劑。在血栓形成時，能特異與血栓中的纖維蛋白結合，并與纖溶酶原形成三元復合物，在血栓處激活纖溶酶原，達到局部溶栓的效果。基于這一特性，美國genentech公司開發了重組人tpa并于1987年上市，通用名為阿替普酶(actilyse)。作為一種高效特異的溶血栓藥，阿替普酶用于心肌梗死、腦血栓等血栓性疾病的搶救和治療。阿替普酶采用cho細胞重組表達，具有與天然tpa相同的生物學活性，對血栓中的纖維蛋白有很高的親和性，而對血液中的纖維蛋白原、凝血因子等沒有作用，這就避免了由于激活全身纖溶系統所帶來的潛在出血危險。重組表達的阿替普酶與天然tpa序列一致，臨床應用不會產生免疫反應等副作用。因此，療效好、安全性高、溶栓后再凝趨勢弱及便于搶救等是該藥的最大優點。

但是，阿替普酶在血液中可以被i型纖溶酶原激活劑抑制物快速、特異地結合，從而失去溶栓活性，也可以與肝細胞、血管內皮細胞上的特異性受體結合而被吞噬和從血液中清除。這一缺點使得其在血液中的半衰期非常短，僅3-6分鐘，這也導致阿替普酶臨床應用劑量大(最大劑量達90mg)、費用昂貴。為了改變這一缺陷，主要從兩方面進行改善：一是延長半衰期，主要是通過構建tpa的突變體，增強其活性或者降低與i型纖溶酶原激活劑抑制物及受體的親和力實現，如德國boehringermannheim公司開發的瑞替普酶、美國genentech公司的tnk酶、美國bristol-myerssquibb公司開發的mpa酶、日本eisai公司開發的孟替普酶等。二是優化tpa的生產工藝，通過改變表達系統、簡化純化步驟等提高生產率。例如，中國發明專利cn1314490公開了在酵母菌中分泌表達人組織纖溶酶原激活劑(htpa)及其活性測定方法。在獲得htpacdna的基礎上，對該基因5’端加以修飾，使其正確插入ppic9載體的α因子信號肽序列下游，經轉化構建陽性工程菌，然而酵母菌表達系統的糖基化形式與哺乳動物細胞存在一定的差異，這些差異將直接影響重組蛋白的活性、穩定性及免疫原性。

中國發明專利cn101085978公開了一種用于動物細胞灌流培養的過濾-沉降雙結合灌流系統，通過改造灌流培養系統的方式提高cho細胞密度和產量。中國發明專利cn101096655公開了一種采用cytopore多孔微載體培養法生產重組人組織型纖溶酶原激活劑tnk突變體的方法，將tnk-tpa基因工程cho細胞株加培養基重新懸浮后，使用cytopore多孔微載體培養tnk-tpa基因工程細胞生產tnk-tpa。中國發明專利cn1786161將含天然或改構的人組織型纖溶酶原激活劑的樣品過親和層析柱，通過特異的仿生親和分離材料提高tpa的純化收率等。

以上的研究多側重于培養和純化工藝方面的改進，而上游工藝特別是表達細胞株的設計和優化卻鮮有報道。然而，當前生產重組tpa及其突變體的方法涉及的環節眾多，是一項復雜的系統工程，而對細胞株構建的過程，如啟動子的選擇、目的基因的序列、篩選標記的選擇等進行深入研究，將更有效地提高tpa的生產效率、并進一步地降低生產成本和使用成本。

基于此，當前對大規模生產重組tpa的高效率、低成本的方法存在需求。

技術實現要素：

為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種編碼tpa的dna分子。本發明提供的編碼tpa的dna分子更有利于哺乳動物細胞表達，極大地提高了tpa的分泌表達效率。進一步地，本發明還提供了包含該dna分子的載體以及其重組細胞株。本發明提供的載體中引入了谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，gs)篩選加壓體系，本發明還提供了用于表達重組人tpa的cho細胞株。

一方面，本發明提供了一種編碼組織型纖溶酶原激活劑的dna分子，其核苷酸序列如seqidno:1所示。其中，本發明所述的編碼tpa的dna分子根據人tpa蛋白序列設計并優化，所述人組織型纖溶酶原激活劑蛋白序列來源于uniprot蛋白質數據庫(uniprotreferencesequence:p00750)，其氨基酸序列如seqidno:2所示。該氨基酸序列共編碼562個氨基酸，分子量為62.9kda，等電點為8.1。

另一方面，本發明提供了一種包含本發明的dna分子的表達載體；優選地，本發明的表達載體為真核生物表達載體，更優選地選自pdna、pcmv、pef系列載體，進一步優選地為pires表達載體；

優選地，本發明所述的表達載體還包括谷氨酰胺合成酶基因。所述谷氨酰胺合成酶基因用作篩選和加壓標記。

再一方面，本發明提供了一種用于表達組織型纖溶酶原激活劑的cho細胞株，所述細胞株包括上述dna分子或上述載體。

再一方面，本發明提供了一種優化所述cho細胞株的方法，所述方法包括引入谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，gs)篩選加壓體系。

本發明還提供了本發明的編碼組織型纖溶酶原激活劑的優化dna分子、包含本發明的優化dna分子的表達載體、用于表達組織型纖溶酶原激活劑的cho細胞株在生產重組組織型纖溶酶原激活劑中的用途。

在本發明的一個實施例中，給出了制備本發明的用于表達組織型纖溶酶原激活劑的cho細胞株的方法，所述方法包括以下步驟：

1)按照哺乳動物細胞密碼子偏好性設計并合成編碼人組織型纖溶酶原激活劑的核苷酸序列，優選地，所述核苷酸序列如seqidno:1所示；

2)將編碼人組織型纖溶酶原激活劑的核苷酸序列構建進入pires表達載體，獲得pires-tpam重組質粒。

3)將gs基因編碼序列構建進入pires-tpam表達載體，獲得pires-tpa-gs重組質粒。

4)將pires-tpam和pires-tpam-gs重組質粒轉染cho-k1哺乳動物細胞株。

5)使用g418(geneticin，遺傳霉素)進行篩選獲得穩定細胞株，并用msx(蛋氨酸亞氨基代砜)加壓獲得高表達的cho/pires-tpam-gs重組細胞株。

與現有技術相比，本發明的技術方案具有以下優點：

1)本發明的dna分子經過優化，避免和降低了影響轉錄和翻譯效率的諸多因素，例如密碼子偏好性、mrna高級結構、gc含量、提前終止序列等，優化后的序列更有利于哺乳動物細胞表達。

2)本發明的技術方案中，將gs基因克隆進入表達載體，構建了gs加壓篩選系統。經過加壓后，組織型纖溶酶原激活劑的拷貝數隨gs基因在細胞內得到擴增，因而，目的蛋白的表達量較非擴增表達系統顯著增加，為大規模生產奠定了基礎。

3)本發明提供的表達組織型纖溶酶原激活劑的cho細胞株極大地提高了表達效率，從而降低了生產和使用成本。

附圖說明

以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：

圖1為本發明的tpa編碼dna序列與天然tpa編碼dna序列的序列比對。

圖2為本發明中pires-tpam質粒和pires-tpam-gs質粒的構建流程圖。

圖3為本發明中對cho/pires-tpam-gs細胞株的篩選結果。

圖4為測定本發明的細胞株培養液上清的活性的顯色反應；

其中，1為未加入細胞培養上清的測活顯色的本底反應；

2為cho/pires-tpa穩定細胞株培養上清的測活顯色反應；

3為cho/pires-tpam穩定細胞株培養上清的測活顯色反應；

4為cho/pires-tpam-gs穩定細胞株培養上清的測活顯色反應；

5為cho/pires-tpam-gs穩定細胞株經msx加壓后培養上清的測活顯色反應。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。

實施例1.編碼人組織型纖溶酶原激活劑的核苷酸序列的密碼子優化

人組織型纖溶酶原激活劑蛋白序列來源于uniprot蛋白質數據庫

(uniprotreferencesequence:p00750)，具體序列如下：

seqidno:2

mdamkrglccvlllcgavfvspsqeiharfrrgarsyqvicrdektqmiyqqhqswlrpvlrsnrveycwcnsgraqchsvpvkscseprcfnggtcqqalyfsdfvcqcpegfagkcceidtratcyedqgisyrgtwstaesgaectnwnssalaqkpysgrrpdairlglgnhnycrnpdrdskpwcyvfkagkyssefcstpacsegnsdcyfgngsayrgthsltesgasclpwnsmiligkvytaqnpsaqalglgkhnycrnpdgdakpwchvlknrrltweycdvpscstcglrqysqpqfrikgglfadiashpwqaaifakhrrspgerflcggilisscwilsaahcfqerfpphhltvilgrtyrvvpgeeeqkfevekyivhkefdddtydndiallqlksdssrcaqessvvrtvclppadlqlpdwtecelsgygkhealspfyserlkeahvrlypssrctsqhllnrtvtdnmlcagdtrsggpqanlhdacqgdsggplvclndgrmtlvgiiswglgcgqkdvpgvytkvtnyldwirdnmrp

按照哺乳動物細胞密碼子偏好性，同時減少序列中gc含量、避免mrna的二級結構、去除剪切位點和終止信號等因素，獲得的優化序列如seqidno:1所示,由南京金斯瑞公司合成并克隆至puc57載體。經優化的序列命名為tpam，含有該序列的puc57重組質粒命名為puc57-tpam。

優化后的tpa編碼dna序列與天然tpa編碼dna序列(genbank:ay221101.1)的比對如圖1所示，兩者的相似度為79％。

實施例2.重組質粒pires-tpam的構建

重組質粒pires-tpam的構建流程如圖1所示。

以puc57-tpam重組質粒為模板，用引物f1和r1進行pcr擴增；

f1:seqidno:3atatctcgagatggacgccatgaagagggg和引物

r1:seqidno:4atatacgcgttcatggccgcatattgtccc。

反應體系為h2o20μl，2×taqpcrmastermix(天根生化科技有限公司的kt201)25μl，10μm引物f11μl，10μm引物r11μl，puc57-tpam質粒1μl。

擴增條件為：94℃2min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共35個循環；94℃5min。

擴增產物大小為1699bp，經瓊脂糖凝膠回收后溶于30μl無菌水中。將擴增回收的產物進行酶切反應，反應體系為：h2o6μl，10×bufferh2μl，xhoi1μl(takara生物技術有限公司)，mlui1μl(takara生物技術有限公司)，擴增回收的產物10μl，反應條件為：37℃3hr。用同樣的體系和條件酶切2μgpires表達載體。

反應結束后回收經酶切的基因片段和表達載體，分別溶于30μl無菌水。將表達載體和基因片段進行連接，反應體系為：h2o4μl，10×ligationbuffer，ligase(newenglandbiolabs公司的m0202v)1μl，酶切回收的基因片段10μl，酶切回收的pires表達載體3μl。室溫放置16hrs。將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞dh5a，涂布于含有氨芐青霉素25μg/ml的lb平板，37℃倒置培養過夜。挑取單菌落進行dna測序驗證，測序結果無誤的質粒用于哺乳動物細胞的轉染。

實施例3.重組質粒pires-tpam-gs的構建

重組質粒pires-tpam-gs的構建流程如圖1所示。

以帶有gs基因編碼序列的puc57-gs重組質粒為模板，用引物f2:seqidno:5atatggatccatggccacctcagcaagttcccact和引物r2:seqidno:6atatgtcgacttagtttttgtattggaagggctcg進行pcr擴增。反應體系為h2o20μl，2×taqpcrmastermix(天根生化科技有限公司的kt201)25μl，10μm引物f21μl，10μm引物r21μl，puc57-gs質粒1μl。擴增條件為：94℃2min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共35個循環；94℃5min。擴增產物大小為1142bp，經瓊脂糖凝膠回收后溶于30μl無菌水中。將擴增回收的產物進行酶切反應，反應體系為：h2o6μl，10×bufferh2μl，bamhi1μl(takara生物技術有限公司)，sali1μl(takara生物技術有限公司)，擴增回收的產物10μl。反應條件為：37℃3hr。用同樣的體系和條件酶切2μgpires-tpa表達載體。反應結束后回收經酶切的基因片段和表達載體，分別溶于30μl無菌水。將表達載體和基因片段進行連接，反應體系為：h2o4μl，10×ligationbuffer，ligase(newenglandbiolabs公司的m0202v)1μl，酶切回收的基因片段10μl，酶切回收的pires-tpam表達載體3μl。室溫放置16hrs。將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞dh5a，涂布于含有氨芐青霉素25μg/ml的lb平板，37℃倒置培養過夜。挑取單菌落進行dna測序驗證，測序結果無誤的質粒用于哺乳動物細胞的轉染。

實施例4.重組質粒pires-tpam和pires-tpam-gs的提取

將測序正確的pires-tpam和pires-tpam-gs分別接種于100ml含50μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養基中，37℃、180rpm振蕩培養過夜。按照天根生化科技有限公司的高純度質粒大提試劑盒(dp116-m)操作說明提取質粒用于哺乳動物細胞的轉染。

實施例5.cho-k1細胞的培養、轉染

cho-k1細胞復蘇之后用cdm4mab培養基(hyclone公司，sh30800)培養，培養條件為37℃，5％co2，120rpm/min。每3天換一次培養液，按1：3比例傳代。傳3代當其存活率達到95％時，進行轉染。

利用默克密理博的novachoice轉染試劑盒(72622-3)，按照說明書進行轉染。具體地，取pires-tpam和pires-tpam-gs各20μl，分別與2ml的培養基、20μl的轉染試劑、10μl的轉染稀釋液混合，室溫孵育30分鐘。將混勻的轉染試劑分別加入20ml培養的細胞中，混勻后繼續培養。轉染48h后加入g418至終濃度800μg/ml，每3天換一次培養液，培養兩周后獲得穩定cho/pires-tpam和cho/pires-tpam-gs細胞株，分別收集細胞培養上清進行活性檢測。

實施例6.cho/pires-tpam-gs細胞的加壓和篩選

取存活率達到95％的cho/pires-tpam-gs細胞，將培養基更換為無谷氨酰胺的cdm4mab培養基進行培養，培養條件為37℃，5％co2，120rpm/min。每3天換一次培養液，傳2代后加入msx至終濃度25μm，每3天換一次培養液，培養兩周收集細胞培養上清進行活性檢測。

用有限稀釋法篩選cho/pires-tpam-gs細胞株。具體的，將濃度為1×10⁶個/ml的cho/pires-tpam-gs的細胞，用cdm4mab培養基稀釋至2-4個細胞/200μl，按照200μl/孔的量鋪于96孔深孔板，于37℃，5％co2，120rpm/min條件下進行培養，至細胞密度達到0.5×10⁵個/ml時轉移至24孔板進行培養，培養3天后取上清分別測定活性。

實施例7.對照cho/pires-tpa細胞株的構建和培養

提取pires-tpa質粒，其中，帶有天然tpa編碼dna序列(序列同genbank:ay221101.1)。轉染宿主細胞cho-k1獲得含有未優化表達序列的cho/pires-tpa重組細胞株，收集培養上清進行活性檢測。質粒提取方法同實施例4，細胞轉染和培養方法同實施例5。

實施例8.組織型纖溶酶原激活劑活性檢測

取細胞培養上清50μl、55u/ml纖溶酶原(abacm公司，gr299758)10μl、10mg/ml牛纖維蛋白原(索萊寶生物技術有限公司，622c061)50μl、1u/ml牛凝血酶(索萊寶生物技術有限公司，522a0214)50μl混合，于37℃溫育10min。加入5mg/mls-2403發色底物(上海冠東生物科技有限公司)40μl混勻，于37℃溫育60min。加入20μl的1.25m醋酸終止劑，測定405nm波長下的吸光度值。取不同濃度的(2-10u)組織型纖溶酶原激活劑標準品(abacm公司，ab92633)，按照上述操作反應，繪制活性-濃度標準曲線，計算細胞上清中組織型纖溶酶原激活劑的活性，結果如表1和圖3所示，含有優化基因序列的cho/pires-tpam穩轉細胞庫的培養上清中tpa的活性是cho/pires-tpa穩轉細胞庫的4倍。經有限稀釋法共篩選了cho/pires-tpam-gs細胞株149株，活性呈正態分布，其中最高一株克隆1c1的表達量達373iu/ml。

以上對本發明具體實施方式的描述并不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求的范圍。

序列表

<110>江蘇康禾生物制藥有限公司

<120>編碼組織型纖溶酶原激活劑的dna分子及其重組細胞株

<130>dic17110009

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1689

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>編碼tpa的優化dna分子

<400>1

atggacgccatgaagaggggcctgtgctgcgtgctgctgctgtgcggcgccgtgttcgtg60

agccccagccaggagatccacgccaggttcaggaggggcgccaggagctaccaggtcatc120

tgcagagacgagaagacccagatgatctatcagcagcaccagtcctggctgcgccctgtg180

ctgagaagcaaccgcgtggagtactgctggtgtaattctggcagggcccagtgtcattcc240

gtgcctgtgaagtcttgctccgagccacggtgtttcaacggcggcacatgccagcaggct300

ctgtatttctccgatttcgtgtgccagtgtcctgagggctttgccggcaagtgctgtgag360

atcgataccagggctacatgttacgaggaccagggcatcagctataggggcacctggtct420

acagctgagtccggagctgagtgcaccaactggaactcctccgccctggctcagaagcct480

tactctggcaggcggccagatgctatcaggctgggactgggcaaccacaattattgtaga540

aatcccgatcgcgactctaagccttggtgctacgtgttcaaggccggcaagtattcttcc600

gagttttgctccaccccagcttgtagcgagggcaactctgactgttactttggcaatggc660

agcgcctatagaggcacccattctctgacagagtccggcgctagctgcctgccatggaac720

tctatgatcctgatcggcaaggtgtacacagctcagaatccatccgcccaggctctggga780

ctgggcaagcacaactattgtcgcaatccagatggcgacgctaagccctggtgccatgtg840

ctgaagaacagacgcctgacctgggagtactgcgatgtgcccagctgctctacatgtggc900

ctgaggcagtattctcagcctcagttccggatcaagggcggcctgtttgccgacatcgct960

agccacccatggcaggccgctatcttcgccaagcataggcggtctcccggcgagaggttt1020

ctgtgcggcggcatcctgatcagctcttgttggattctgtccgccgctcactgcttccag1080

gagcggtttccccctcaccatctgaccgtgatcctgggcaggacataccgggtggtgcca1140

ggcgaggaggagcagaagttcgaggtggagaagtacatcgtgcataaggagtttgacgat1200

gacacctatgataacgacatcgccctgctgcagctgaagagcgactccagcagatgtgct1260

caggagtcttccgtggtgcgcaccgtgtgcctgccaccagccgatctgcagctgccagac1320

tggacagagtgtgagctgtccggatacggcaagcacgaggccctgtcccctttctatagc1380

gagaggctgaaggaggctcacgtgagactgtacccaagctctcgctgtaccagccagcat1440

ctgctgaacagaaccgtgacagataatatgctgtgcgctggcgacacacgctccggagga1500

ccacaggctaacctgcatgatgcttgtcagggcgacagcggaggacctctggtgtgcctg1560

aatgatggccggatgaccctggtgggcatcatctcttggggactgggatgcggacagaag1620

gacgtgcctggcgtgtacaccaaggtgacaaactatctggattggatcagggacaatatg1680

cggccatga1689

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>tpa的氨基酸序列

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151015

alavalphevalserproserglngluilehisalaargpheargarg

202530

glyalaargsertyrglnvalilecysargaspglulysthrglnmet

354045

iletyrglnglnhisglnsertrpleuargprovalleuargserasn

505560

argvalglutyrcystrpcysasnserglyargalaglncyshisser

65707580

valprovallyssercyssergluproargcyspheasnglyglythr

859095

cysglnglnalaleutyrpheseraspphevalcysglncysproglu

100105110

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115120125

gluaspglnglyilesertyrargglythrtrpserthralagluser

130135140

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145150155160

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165170175

asntyrcysargasnproaspargaspserlysprotrpcystyrval

180185190

phelysalaglylystyrsersergluphecysserthrproalacys

195200205

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210215220

glythrhisserleuthrgluserglyalasercysleuprotrpasn

225230235240

sermetileleuileglylysvaltyrthralaglnasnproserala

245250255

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260265270

aspalalysprotrpcyshisvalleulysasnargargleuthrtrp

275280285

glutyrcysaspvalprosercysserthrcysglyleuargglntyr

290295300

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305310315320

serhisprotrpglnalaalailephealalyshisargargserpro

325330335

glygluargpheleucysglyglyileleuilesersercystrpile

340345350

leuseralaalahiscyspheglngluargpheproprohishisleu

355360365

thrvalileleuglyargthrtyrargvalvalproglyglugluglu

370375380

glnlysphegluvalglulystyrilevalhislysglupheaspasp

385390395400

aspthrtyraspasnaspilealaleuleuglnleulysseraspser

405410415

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420425430

proalaaspleuglnleuproasptrpthrglucysgluleusergly

435440445

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450455460

glualahisvalargleutyrproserserargcysthrserglnhis

465470475480

leuleuasnargthrvalthraspasnmetleucysalaglyaspthr

485490495

argserglyglyproglnalaasnleuhisaspalacysglnglyasp

500505510

serglyglyproleuvalcysleuasnaspglyargmetthrleuval

515520525

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530535540

valtyrthrlysvalthrasntyrleuasptrpileargaspasnmet

545550555560

argpro

<210>3

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<213>人工序列

<220>

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atatctcgagatggacgccatgaagagggg30

<210>4

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<213>人工序列

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<223>引物r1

<400>4

atatacgcgttcatggccgcatattgtccc30

<210>5

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物f2

<400>5

atatggatccatggccacctcagcaagttcccact35

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<211>35

<212>dna

<213>人工序列

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<223>引物r2

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atatgtcgacttagtttttgtattggaagggctcg35