OsNPF5.11基因在提高水稻產量中的應用的制作方法

本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及osnpf5.11基因在提高水稻產量中的應用。

背景技術：

植物通過吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等來獲得氮素；氮的吸收和轉運主要依靠銨根運輸蛋白（amt）、硝酸根運輸蛋白（nrt）、氨基酸運輸蛋白（aat）、肽運輸蛋白（ptr）等運輸蛋白來完成（williamsl,millera.transportersresponsiblefortheuptakeandpartitioningofnitrogenoussolutes.annualreviewofplantphysiologyandplantmolecularbiology,2001,52:659-688.）。銨通過植物amt吸收后再通過谷氨酰胺合成酶（gs）和谷氨酸合酶（gogat）合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再進一步形成其它氨基酸（sonoday,ikedaa,saikis,etal.feedbackregulationoftheammoniumtransportergenefamilyamt1byglutamineinrice.plantcellphysiology,2003,44:1396-1402.）。植物可通過高親和轉運系統（hats）的nrt2和低親和轉運系統（lats）的nrt1吸收環境中的硝酸鹽，由硝酸還原酶（nr）和亞硝酸還原酶（nir）還原形成銨，再進一步形成氨基酸（paungfoo-lonhiennec,lonhiennetg,rentschd,etal.plantscanuseproteinasanitrogensourcewithoutassistancefromotherorganisms.proceedingsofthenationalacademyofsciences,2008,105:4524-4529.）。

氮運輸npf家族包括nrt1和ptr亞家族，不同成員在植株不同部位運輸硝酸根、寡肽或氨基酸等，在植株生長發育上起不同的作用（rentschd,schmidts,tegederm.transportersforuptakeandallocationoforganicnitrogencompoundsinplants.febsletters,2007,581:2281-2289.）。osnpf2.2介導了木質部硝酸根的卸載，影響水稻生長（liy,ouyangj,wangyy,etal.disruptionofthericenitratetransporterosnpf2.2hindersroot-to-shootnitratetransportandvasculardevelopment.scientificreports,2015,5:9635.）。osnpf7.2對硝酸根有低親和運輸，能夠影響植株生長（hur,qiud,cheny,etal.knock-downofatonoplastlocalizedlow-affinitynitratetransporterosnpf7.2affectsricegrowthunderhighnitratesupply.frontiersinplantscience,2016,7.）。

雖然已知氮營養可以促進植物生長發育，但是氮營養影響了植株什么類型的生長發育目前還沒有系統的了解。另外水稻npf家族有80多個成員，氮營養是通過npf基因家族什么成員進行響應，在什么部位介導了氮營養運輸，從而影響了植株什么類型的生長發育，目前也幾乎未知。所以，挖掘出npf家族中可能具有氮高效運輸基因，特別是能夠控制水稻株型的氮運輸關鍵基因，將有利于水稻高產品種的培育。本發明通過長期研究后發現，npf家族osnpf5.11基因有兩種選擇性剪接形式，第一種剪接形式發揮主要作用，對水稻分蘗有重要的正調控作用。序列通過超表達后，可直接應用于植物株型改良，從而使水稻增產。

技術實現要素：

本發明的目的在于解決現有技術中存在的問題，提供水稻npf基因家族成員osnpf5.11基因在提高水稻產量中的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

本發明以水稻的npf基因家族成員osnpf5.11基因為對象，從水稻中花11中克隆了osnpf5.11的cdna序列。通過構建osnpf5.11基因超表達載體，采用農桿菌eha105介導的遺傳轉化方法，將超表達載體導入正常粳稻品種中花11中，得到osnpf5.11基因超表達植株，其分蘗數、灌漿粒數與對照野生型中花11相比顯著提高。通過rnai技術構建osnpf5.11基因干擾表達載體，將干擾表達載體導入中花11中，得到osnpf5.11基因表達量下降的干擾植株，干擾植株的分蘗數、灌漿粒數與中花11相比顯著降低。這些結果表明，通過提高osnpf5.11基因的表達，可以使正常的水稻分蘗數、灌漿粒數增加，從而提高水稻產量。

基于本發明發現的osnpf5.11基因的功能，osnpf5.11基因可用于水稻選育中。所述的水稻選育為提高水稻分蘗數、灌漿粒數，從而提高水稻產量。具體可通過提高osnpf5.11基因的表達使水稻分蘗數和每株灌漿粒數增加，達到提高水稻產量的目的。

osnpf5.11基因也可用于提高其他植物的產量，如通過轉基因使osnpf5.11基因在植物中（超量）表達，來提高植物的分枝數量，進而使植物的產量得到提高。所述的植物是指單子葉植物或雙子葉植物；如：小麥、番茄、草坪草或苜蓿等。

所述的osnpf5.11基因編碼的osnpf5.11蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示；所述的osnpf5.11基因的cdna序列優選如seqidno.2所示。

應該理解為，在不影響osnpf5.11蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本領域技術人員可對seqidno.1所示的氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。因此，osnpf5.11蛋白還包括seqidno.1所示氨基酸序列經取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸獲得的具有同等活性的蛋白質。此外，應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員可以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。

本發明的優點和效果：

（1）本發明克隆的osnpf5.11基因超表達后使水稻分蘗數和灌漿粒數增加，說明osnpf5.11基因對提高水稻產量有明顯影響，因此，通過基因工程技術提高osnpf5.11基因的表達能夠提高植物產量。這不僅有助于通過正常施氮條件下培育高產水稻，還可以通過分子育種進行植物的品種改良。

（2）osnpf5.11基因的成功克隆，進一步證實了npf家族在氮吸收過程中的重要作用，對闡明npf家族的生物學功能有重要的意義，另外對進一步了解植物氮代謝途徑，提高氮吸收效率有極大的推動作用。

（3）盡管目前已克隆到了一些提高植物產量的基因，但對植物增產的分子機制仍不清楚。而本發明克隆的osnpf5.11基因能夠提高水稻的產量，對確定植物增產的關鍵因素有極大的推動作用。

附圖說明

圖1是對照中花11、osnpf5.11基因超表達植株2個株系和osnpf5.11基因干擾植株2個株系的整株表型圖。

圖2是對照中花11、osnpf5.11基因超表達植株2個株系和osnpf5.11基因干擾植株2個株系分蘗數的統計柱狀圖，數據采用spss軟件進行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進行差異顯著性分析，不同組別小寫字母（a、b、c）表示差異顯著。

圖3是對照中花11、osnpf5.11基因超表達植株2個株系和osnpf5.11基因干擾植株2個株系的每株種子灌漿粒數圖。

圖4是對照中花11、osnpf5.11基因超表達植株2個株系和osnpf5.11基因干擾植株2個株系每株種子灌漿粒數的統計柱狀圖，數據采用spss軟件進行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進行差異顯著性分析，不同組別小寫字母（a、b、c）表示差異顯著。

圖5是對照中花11、osnpf5.11基因超表達植株2個株系和osnpf5.11基因干擾植株2個株系中osnpf5.11基因相對表達量的統計柱狀圖，數據采用spss軟件進行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進行差異顯著性分析，不同組別小寫字母（a、b、c）表示差異顯著。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步詳細的說明，但本發明的實施方式不限于此。若未特別指明，下述實施例所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段；所用的實驗方法均為常規方法，并可按照已描述的重組技術（參見分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約）完成；所用的材料、試劑等，均可從商業途徑得到。

實施例1osnpf5.11基因超表達植株的構建

提取水稻中花11的rna，并將其反轉錄成cdna，利用引物對：

f1：5'-ggtaccatgtcggggaagaagccgacggcg-3'（kpni），

r1：5'-tctagagtagtacttgcacaagtgtgtgaa-3'（xbai）；

通過pcr擴增osnpf5.11基因的cdna后，通過kpni、xbai酶切后連入pcambia-1306載體（pcambia-1306載體購自cambia公司），構建出osnpf5.11基因的超表達載體osnpf5.11-p1306。采用農桿菌eha105介導的遺傳轉化方法，將超表達載體導入正常水稻品種中花11中。

將得到的所有轉基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長高約10cm時，種于大田中，待苗長大后，提取基因組dna通過pcr對轉基因植株進行檢測，檢測引物對為：

f2：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r2：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'。

若擴增出517bp的片段，則說明轉基因植株為陽性植株。陽性植株單株收種并種植，直至t2代鑒定出純合的轉基因植株，即得到osnpf5.11基因超表達植株。osnpf5.11基因超表達植株的分蘗數遠多于對照中花11植株，差異顯著，如圖1、2中所示。單株收取種子，發現超表達植株每株灌漿粒數顯著多于對照中花11植株，如圖3、4中所示。

取osnpf5.11基因超表達植株葉片，提取rna并將其反轉錄成cdna，通過實時熒光定量pcr檢測osnpf5.11基因的表達量，結果顯示（圖5）超表達植株osnpf5.11基因的表達量與對照中花11相比顯著升高。實時熒光定量pcr所用引物對為：

f3：5'-aggctgagcagggcatgcgtga-3'，

r3：5'-agcatggacgtcaccccgct-3'。

實施例2osnpf5.11基因干擾植株的構建

提取水稻中花11的rna，并將其反轉錄成cdna，利用引物對：

f4：5'-ggtaccaggctgagcagggcatgcgtga-3'（kpni），

r4：5'-ggatcctgtagccgccttggccgatgga-3'（bamhi）；

f5：5'-actagtaggctgagcagggcatgcgtga-3'（spei），

r5：5'-gagctctgtagccgccttggccgatgga-3'（saci）；

各自pcr擴增出osnpf5.11基因的cdna片段后，通過相應的限制性內切酶酶切后連入ptck303載體，構建出osnpf5.11基因的干擾表達載體osnpf5.11-ptck303。采用農桿菌eha105介導的遺傳轉化方法，將干擾表達載體導入正常粳稻品種中花11中。

將得到的所有轉基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長高約10cm時，種于大田中，待苗長大后，提取基因組dna通過pcr對轉基因植株進行檢測，檢測引物對為：

f2：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r2：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'。

若擴增出517bp的片段，則說明轉基因植株為陽性植株。陽性植株單株收種并種植，直至t2代鑒定出純合的轉基因植株，即得到osnpf5.11基因干擾植株。osnpf5.11基因干擾植株的分蘗數遠少于對照中花11植株，差異顯著，如圖1、2中所示。單株收取種子，發現干擾植株每株灌漿粒數明顯少于對照中花11植株，如圖3、4中所示。

取osnpf5.11基因干擾植株葉片，提取rna并將其反轉錄成cdna，通過實時熒光定量pcr檢測osnpf5.11基因的表達量，結果顯示（圖5）干擾植株osnpf5.11基因的表達量與對照中花11相比顯著降低。實時熒光定量pcr所用引物同實施例1。

上述結果表明，通過提高osnpf5.11基因的表達，可以增加水稻的分蘗數和灌漿粒數，進而提高水稻產量。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。

sequencelisting

<110>武漢生物工程學院

<120>osnpf5.11基因在提高水稻產量中的應用

<130>1

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