微孔板法測定P型紅輝沸石分子篩抗菌劑抗菌性能的方法與流程

本發明屬于復合生物技術領域，特別涉及一種微孔板法測定p型紅輝沸石分子篩抗菌劑抗菌性能的方法。

背景技術：

由于抗生素的大量使用，細菌的耐藥性逐漸增強，尤其是超級細菌的出現，傳統抗生素的利用受到極大限制，生產新型抗菌藥物成為抗菌問題的關鍵。

廣西紅輝沸石礦屬于低溫熱液型，含量豐富，并且具有較高的可塑性，成為抗菌物質載體的首選。p型紅輝沸石分子篩抗菌劑的合成，將p型紅輝沸石分子篩，殼聚糖和二甲酸鉀按3:1:2的比例稱量，取稱量的分子篩加水攪拌，用低濃度的鹽酸調節ph至6，同時將殼聚糖和二甲酸鉀攪拌呈凝膠狀，最后將混合液倒入分子篩溶液中攪拌，反應時間為2h，溫度控制在40℃。p型紅輝沸石分子篩抗菌劑具有高效、廣譜、持久、可加工性好、安全穩定的特點。

分子篩，又名沸石，有很強的離子置換能力，是一類硅酸鹽或硅鋁酸鹽晶體材料。它既天然存在也可以人工合成，具有規則微孔和四面體骨架單元。其氧原子相互聯接，構成規則孔道的三維結構。分子篩的硅鋁比決定了其化學性質，熱穩定性和局部的極性。此外，它的尺寸和形狀選擇性以及離子交換性等由自身的孔道形狀，大小以及硅鋁比決定。研究表明，分子篩具有生物活性，生物穩定性以及良好的生物相容性，引起國內外研究人員的廣泛關注和重視。不僅如此，沸石可以抗細菌、抗病毒以及抗真菌。

殼聚糖，是一種天然氨基多糖，由甲殼素經脫乙酰化劑制得。其中甲殼素經脫乙酰化劑廣泛存在于節肢動物外殼和真菌類細胞壁中。殼聚糖是無毒的，并且它的生物降解，生物相容及生物活性功能，成膜特性和抗菌防腐能力都存在巨大的優勢。

二甲酸鉀，又稱雙甲酸鉀，是一種有機酸鹽。它為白色或微黃色，易溶于水，酸性條件下較穩定，在中性或偏堿性的環境下易分解為甲酸與甲酸鉀。其無抗藥性、無殘留、無毒害，可作為抗生素替代品。并且可以降低消化道ph值，增強胃蛋白酶活性，促進蛋白質消化吸收，抑制有害微生物繁殖，促進有益菌增殖。

楊曉楠，王猛等人利用酶標儀建立番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)對殺菌劑敏感性的快速、高效測定方法。以od增加值作為評價指標，確立微孔板法檢測灰霉病菌敏感性的測試條件,并對啶酰菌胺、嘧菌酯、乙霉威、甲基硫菌靈、異菌脲、苯醚甲環唑6種常用殺菌劑對灰霉病菌孢子萌發和菌絲生長的抑制效果進行評價，將結果與孢子萌發法和菌絲生長速率法所得結論進行比對。

劉峰駱，健美等人建立了一種新型的微孔板生物檢測用于快速測定大量納他霉素樣品含量。結果表明：微孔板中納他霉素濃度在0.95~2.14mg/l與抑菌率呈較顯著的線性關系，微孔板生物檢測法與hplc法測定的結果無顯著差異，該方法具有處理量大、操作簡單、平行性好等特點，可用于發酵過程中納他霉素產量的定量和突變菌的高通量快速篩選工作。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種微孔板法測定p型紅輝沸石分子篩抗菌劑抗菌性能的方法。

具體步驟為：

(1)稱取p型紅輝沸石分子篩抗菌劑敞開置于超凈工作臺紫外滅菌，然后加入到無菌液體培養基中，分別配制成濃度為6mg/ml、12mg/ml、24mg/ml、48mg/ml、96mg/ml的梯度濃度抗菌劑。

(2)在96微孔板中，取1個微孔作為空白對照孔，加入200μl無菌液體培養基；取1個微孔作為菌液對照孔，加入200μl待測菌培養液；其余每排微孔作為梯度濃度抗菌劑測定孔，向其中加入200μl步驟(1)配制的梯度濃度抗菌劑，每個濃度加3個微孔，然后再加入10μl待測菌培養液，用封口膜封口，在37℃下以220r/min的轉速振蕩培養18h后觀察各個微孔的濁度。

(3)分析步驟(2)的觀察結果，澄清的微孔表示無細菌生長，渾濁的微孔則表示有細菌生長，以無細菌生長的最小濃度作為p型紅輝沸石分子篩抗菌劑的最小抑菌濃度；依次取無細菌生長的各微孔培養物100μl，涂布于固體培養基上，37℃下培養18h，平板上菌落數小于5個的最大濃度即為p型紅輝沸石分子篩抗菌劑的最小殺菌濃度。

(4)分別取50ml步驟(1)配制的梯度濃度抗菌劑，每個濃度取3份，并加入100μl已活化的待測菌，同時增加一組空白，然后均置于37℃下以220r/min的轉速振蕩培養48h，期間每2h取菌液200μl，裝入96微孔板中，利用酶標儀在630nm處測定od值，根據測得數據繪制抗菌劑對待測菌的生長曲線圖，即實現微孔板法測定p型紅輝沸石分子篩抗菌劑抗菌性能。

所述待測菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌中的一種。

本發明方法操作簡單，對于紅輝沸石抗菌的抗菌率的分析，其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的生長曲線均有影響，濃度越大抑菌效果越明顯；微孔梯度法和傳統試管梯度法的結論是一致的，說明微孔板法測定紅輝沸石分子篩抗菌劑抗菌性能的方法是可靠的，且微量、快速。

附圖說明

圖1為本發明實施例中p型紅輝沸石分子篩抗菌劑對大腸桿菌生長曲線的影響。

圖2為本發明實施例中p型紅輝沸石分子篩抗菌劑對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響。

圖3為本發明實施例中p型紅輝沸石分子篩抗菌劑對枯草芽孢桿菌生長曲線的影響。

具體實施例

對照例：

使用傳統試管梯度法測定p型紅輝沸石分子篩抗菌劑的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度。

稱取p型紅輝沸石分子篩抗菌劑0.3g，0.6g，1.2g，2.4g，4.8g各9份，分別加入已滅菌的50ml普通培養基為待測液，將已活化的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌100μl加入待測液中，相應濃度的p型紅輝沸石分子篩抗菌劑作樣品對照。將試管放入振蕩培養箱，轉速調為220r/min，37℃恒溫培養。18h后觀察。培養液澄清，搖勻后仍澄清的試管表示無細菌生長，培養液渾濁則表示有細菌生長。以無細菌生長的最小濃度作為p型紅輝沸石分子篩抗菌劑的最小抑菌濃度值。依次取未見細菌生長的各管培養物100μl，涂布于固體培養基上，37℃培養18h。平板上菌落數小于5個的最大濃度即為p型紅輝沸石分子篩抗菌劑的最小殺菌濃度值。

實施例：

在96微孔板中，取3個微孔作為空白對照孔，每個微孔內分別裝有200μl無菌液體培養基；取9個微孔作為菌液對照孔，分別為枯草芽孢桿菌培養液，金黃色葡萄球菌培養液和大腸桿菌培養液，每孔均為200μl。其余每排微孔作為不同濃度的樣品測定孔，每個濃度3個微孔。稱取p型紅輝沸石分子篩抗菌劑配制成梯度濃度為96，48，24，12，6mg/ml，取200μl加入微孔板中，再依次加入10μl細菌培養液，封口膜封口。37℃轉速調為220r/min振蕩培養18h后觀察，比較各個微孔之間的濁度。培養液澄清，搖勻后仍澄清的微孔表示無細菌生長，培養液渾濁則表示有細菌生長。以無細菌生長的最小濃度作為p型紅輝沸石分子篩抗菌劑的最小抑菌濃度值。依次取未見細菌生長的各孔培養物100μl，涂布于固體培養基上，37℃培養18h。平板上菌落數小于5個的最大濃度即為p型紅輝沸石分子篩抗菌劑的最小殺菌濃度值。

稱取p型紅輝沸石分子篩抗菌劑為0.3g，0.6g，1.2g，2.4g，4.8g各9份，分別加入已滅菌的50ml培養基為待測液，將已活化的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌100μl加入待測液中，同時做一組空白。于37℃轉速調為220r/min振蕩培養48h，每2h取菌液200μl，裝入96微孔板中，利用酶標儀在630nm處測定od值，并根據測得數據繪制生長曲線圖，即實現微孔板法測定p型紅輝沸石分子篩抗菌劑抗菌性能。

實驗結果表明，p型紅輝沸石分子篩抗菌劑對三種菌的最小抑菌濃度均在12~24mg/ml之間，最小殺菌濃度均在48~96mg/ml之間。