雜環苦參堿衍生物及其制備方法和應用與流程

本發明涉及化合物及其分離制備技術領域，更具體地，涉及一種雜環苦參堿衍生物及其制備方法和應用。

背景技術：

長期以來，惡性腫瘤已成為嚴重危害人類生命和生活質量的主要疾病之一,成為人類首要死因，而且，隨著經濟的發展以及人們對環境保護的不力，惡性腫瘤的致死率還在不斷增長。世界衛生組織預測，到2020年，將有2000萬新發惡性腫瘤病例，其中死亡人數達1200萬，且絕大部分將發生在發展中國家。對于惡性腫瘤的治療，天然產物及其衍生物藥物發揮著重要作用。據報道，1981年到2008年間，天然產物來源的抗腫瘤藥物占上市抗腫瘤藥物的60％以上，而且，新型天然產物及其衍生物作為新的抗腫瘤藥物所占數量還在不斷增加。

苦參堿是于1958年首次被植物學家從苦參植物中分離和確認，是屬于一類獨特的生物堿，學名為喹里西啶生物堿，目前，國內外許多學者對苦參堿類化合物的化學成分、藥理作用以及臨床應用均已進行了較為詳細的研究，發現苦參堿類化合物具有顯著的抗腫瘤、抗炎、鎮痛、抗病毒等多種生物活性。苦參堿因具有獨特的分子結構和豐富的生物活性，使其成為開發新藥物的重要先導化合物。結構修飾可以對天然活性化合物的原始結構進行修飾或改造，改善缺點，提高活性，解決原有結構存在的影響藥效問題。苦參堿的d環13,14-位是重要的可修飾鍵位，對其修飾，能夠獲取一系列具抗腫瘤、抗炎、抗菌、鎮痛等活性的衍生物。

植物源農藥屬于綠色農藥的一大類,具有作用靶標多樣性，無環境殘留，對人畜安全等優點。分析植物化學成分，探尋具有農用生物活性的天然化合物，創制新型綠色農藥成為當前農藥開發的主流之一。苦參堿也是一種傳統生物農藥，它對棉鈴蟲(heliothisarmigera)、褐飛虱(nilaparvatalugens)、菜青蟲(pierisrapaelinne)、小菜蛾(plutellaxylostella)等20多種害蟲具有毒殺作用，對多種植物致病菌也有較好的抑制作用；苦參堿單劑或與其他農藥混配的殺蟲效果比部分化學農藥高，且混配能顯著提高苦參堿的藥效和殺蟲譜。目前苦參堿農用方面的基礎研究僅局限于藥效試驗和形態層面的毒理分析；應用開發主要集中于從各種植物中提取和分離苦參堿類化合物，再以粗提物形式應用于農業生產，或以其與其它農藥混配發展商品化的農藥品種，這些應用均比較粗放，未能充分體現苦參堿作為重要植物源農藥的價值，因此，開發高效的新型苦參堿類農藥是當前的重要任務。近年，隨著計算機輔助技術引入農藥分子設計，加快了新型農藥的開發步伐，取得了顯著成果。運用這些技術以植物活性成分為先導化合物，以其活性機理為理論依據，對先導化合物進行結構修飾和改造，已開發出一系列高效的環保型農藥，如擬除蟲菊類、煙堿類、阿維菌素等。苦參堿是創制新型環保農藥的優良先導化合物，然而目前針對農業害蟲，以苦參堿為先導化合物，結構修飾、篩選新活性衍生物的研究尚未開展。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是針對現有以苦參堿為先導化合物經結構修飾獲得新的活性衍生物的技術不足，提供一種雜環苦參堿衍生物。

本發明要解決的另一技術問題是提供所述雜環苦參堿衍生物的制備方法。

本發明還一要解決的另一技術問題是提供所述雜環苦參堿衍生物的應用。

本發明的目的通過以下技術方案予以實現：

提供一種雜環苦參堿衍生物，其結構如式(ⅰ)所示：

其中，所述雜環基團為吲哚或環己胺

本發明同時提供了所述苦參堿衍生物的制備方法，苦參堿d環含有內酰胺結構，13，14位均為飽和鍵，性能穩定，引入基團的難度相對較大，本發明創造性地以13、14位帶不飽和雙鍵的苦參堿衍生物槐果堿為原料，在其13位分別成功引入吲哚和環己胺兩個雜環基團，修飾合成兩個雜環基苦參堿衍生物，經過重結晶獲得晶體，再進行單晶衍射和結構分析，確定其分別為吲哚基苦參堿(衍生物ⅱind-mat)和環己胺基苦參堿(衍生物ⅲcyc-mat)。結構式分別如式(ⅱ)或式(ⅲ)所示：

本發明提供所述吲哚基苦參堿(ind-mat)制備方法包括以下步驟：

s01.粗產品制備：通n2條件下，加入槐果堿、吲哚、氟化銫和石油醚，加熱保持恒溫，滴加四甲氧基硅烷，反應；反應結束后，稍冷卻，加入二氯甲烷，攪拌后過濾，濾液蒸去溶劑后得粗產品。

優選地，所述吲哚基苦參堿(ind-mat)經過以下純化結晶操作步驟可以獲得所述衍生物晶體：

s02.分離純化：采用硅膠柱層析法，用200～300目硅膠作為固定相，流動相為乙酸乙酯和乙醇混合物，濕法裝柱完成后，反復用流動相過柱活化；封口，流動相浸泡靜置過夜；

進樣與洗脫：使用少量洗脫劑溶解試樣后上樣，樣品完全滲入硅膠柱后，加入洗脫劑開始洗脫。每流出5ml餾分收集一次，蒸去大部分溶劑后用于檢測；

檢測：tlc薄層色譜跟蹤檢測分析分離液中目標產物的開始流出時間和洗脫劑體積，目標物洗脫完畢時間和洗脫溶劑體積，合并目標產物開始流出和洗脫完畢時間點之間的所有洗脫樣品，濃縮；

s03.重結晶：

將步驟s02所得濃縮的產品用重結晶溶劑溶解，揮發得油狀物，吸出油狀物，加入溶劑，超聲溶解后繼續揮發，重復2～3次，得到目標衍生物(ⅱ)。

進一步優選地，步驟s02所述流動相為乙酸乙酯：乙醇按照體積比為10:1的混合物。

進一步優選地，步驟s03所述所述重結晶溶劑是正己烷和無水乙醇按照體積比為6：1的混合物。

本發明同時提供所述環己胺基苦參堿(cyc-mat)制備方法，包括以下步驟：

s11.粗產品制備：按比例將槐果堿、環己胺和水混合后在磁力攪拌下恒溫油浴加熱反應，反應結束后，稍冷卻，加入二氯甲烷，攪拌后過濾，濾液蒸去溶劑后得粗產品。

優選地，所述環己胺基苦參堿(cyc-mat)經過以下純化結晶操作步驟可以獲得所述衍生物晶體：

s12.分離純化：采用硅膠柱層析法，用200～300目硅膠作為固定相，流動相為乙酸乙酯和乙醇混合物，濕法裝柱完成后，反復用流動相過柱活化；封口，流動相浸泡靜置過夜；

進樣與洗脫：使用少量洗脫劑溶解試樣后上樣，樣品完全滲入硅膠柱后，加入洗脫劑開始洗脫，每流出5ml餾分收集一次，蒸去大部分溶劑后用于檢測；

檢測：tlc薄層色譜跟蹤檢測分析分離液中目標產物的開始流出時間和洗脫劑體積，目標物洗脫完畢時間和洗脫溶劑體積，合并目標產物開始流出和洗脫完畢時間點之間的所有洗脫樣品，濃縮；

s13.將步驟s12所得濃縮的樣品，用溶劑溶解，常溫揮發掉溶劑得到晶體，獲得目標衍生物ⅲ。

進一步優選地，步驟s12所述流動相為乙酸乙酯：乙醇按照體積比為1:8的混合物。

進一步優選地，步驟s13所述溶劑為石油醚。

本發明還提供了所述雜環苦參堿衍生物的應用，具體是在制備具有抗腫瘤活性藥物或者農藥方面的應用。

抗腫瘤活性應用尤其是在應用于制備抗人宮頸癌細胞株的藥物方面具有良好的效果。進一步地，衍生物ind-mat在0.32～0.64mmol/l劑量濃度條件下對腫瘤細胞具有顯著的抑制作用，并表現出明顯時效性，在相同濃度下cyc-mat對細胞的抑制作用隨時間的增大而增強，在相同作用時間內隨濃度的增加而增強。衍生物cyc-mat在0.8～1.6mmol/l劑量濃度條件下對腫瘤細胞具有顯著的抑制作用，并表現出明顯時效性，在相同濃度下cyc-mat對細胞的抑制作用隨時間的增大而增強，在相同作用時間內隨濃度的增加而增強，。

優選地，所述制備農藥方面的應用主要是制備應用于防治農業害蟲的環保型農藥的候選化合物。所述害蟲包括但不限于棉鈴蟲(heliothisarmigera)、褐飛虱(nilaparvatalugens)、菜青蟲(pierisrapaelinne)、小菜蛾(plutellaxylostella)、草地貪夜蛾(s.frugperda)等

進一步地，應用于抑制草地貪夜蛾(s.frugperda)sf9細胞系方面。衍生物ind-mat在2.5mm的濃度能夠明顯誘導所述細胞凋亡，3mm濃度對細胞增殖生長抑制率超過80％。1.2mmcyc-mat對sf9細胞抑制率超過60％。在苦參堿13鍵位上引入吲哚和環己胺兩個種雜環，能夠顯著提高其昆蟲細胞抑制活性。

本發明的有益效果：

本發明公開了兩種新的雜環基苦參堿衍生物，所述衍生物具有良好的抗腫瘤和殺蟲活性，所獲得兩種苦參堿衍生物對腫瘤細胞或昆蟲細胞具有明顯的抑制作用，填補了本領域技術不足，可用于抗腫瘤藥物或殺蟲劑研究開發，因此本發明為開發新的抗腫瘤或殺蟲活性苦參堿衍生物提供了候選化合物，對全面開發苦參堿的醫用活性和農用活性具有重要的意義。

實驗證明，0.32～0.64mmol/l的衍生物ind-mat對腫瘤細胞有良好的抑制作用，并表現出明顯時效性，在相同濃度下cyc-mat對細胞的抑制作用隨時間的增大而增強；在相同作用時間內隨濃度的增加而增強。0.8～1.6mmol/l的衍生物cyc-mat對腫瘤細胞具有良好的抑制作用，并表現出明顯時效性，在相同濃度下cyc-mat對細胞的抑制作用隨時間的增大而增強；在相同作用時間內隨濃度的增加而增強。

所述衍生物具有抑制以草地貪夜蛾(s.frugperda)sf9細胞系為典型代表的農用活性方面。衍生物ind-mat在2.5mm的濃度能夠明顯誘導所述細胞凋亡，3mm濃度對細胞增殖生長抑制率超過80％。1.2mmcyc-mat對sf9細胞抑制率超過60％。在苦參堿13鍵位上引入吲哚和環己胺兩個種雜環，能夠顯著提高其昆蟲細胞抑制活性。

本發明進一步提供了所述兩種衍生物的制備方法，是在先導化合物苦參堿13鍵位上引入吲哚或環己胺雜環，顯著提高苦參堿的生物活性，制備方法條件溫和，簡單易行。

附圖說明

圖1衍生物吲哚基苦參堿(ind-mat)的晶體形態圖。

圖2衍生物吲哚基苦參堿(ind-mat)的ms分析結果。

圖3衍生物吲哚基苦參堿(ind-mat)的單晶衍生結果。

圖4衍生物環己胺基苦參堿(cyc-mat)的單晶衍生結果。

圖5環己胺基苦參堿(cyc-mat)的晶體形態圖。

圖6衍生物對hela229細胞顯微形態影響。

圖7衍生物對sf9細胞顯微形態影響。

具體實施方式

下面結合具體實施例進一步說明本發明。下述實施例僅用于示例性說明，不能理解為對本發明的限制。除非特別說明，下述實施例中使用的試劑為常規市購或商業途徑獲得的試劑，除非特別說明，下述實施例中使用的方法和設備為本領域常規使用的方法和設備。

實施例1吲哚基苦參堿(ind-mat)制備

s01.制備粗產品

100ml三口燒瓶，通入n25min后，加入槐果堿1.23g，吲哚0.585g，氟化銫0.76g與石油醚12ml。調整n2流速，5min后開始甘油油浴加熱，保持恒溫80℃，滴加0.5ml四甲氧基硅烷；反應6h后停止加熱。反應過程中溶劑量保持在4～5ml不足時可補充2～3ml。反應結束后，稍冷卻，加入10ml二氯甲烷，攪拌后過濾，濾液蒸去溶劑后得粗產品。

s02.分離純化和結構表征

將步驟s01所得粗產品采用硅膠柱層析法分離純化。

(1)分離條件

固定相：200～300目硅膠230ml；

篩選洗脫體系：tlc法篩選洗脫溶劑體系，最后確定柱色譜分離流動相為乙酸乙酯：乙醇＝10:1。

裝柱與活化：濕法裝柱完成后，反復用流動相過柱活化；封口，流動相浸泡靜置過夜。

進樣與洗脫：使用少量洗脫劑溶解試樣后上樣，樣品完全滲入硅膠柱后，加入洗脫劑開始洗脫。每流出5ml餾分收集一次，蒸去大部分溶劑后用于檢測。檢測：tlc薄層色譜跟蹤檢測分析分離液中目標產物的開始流出時間和洗脫劑體積，目標物洗脫完畢時間和洗脫溶劑體積。合并目標產物開始流出和洗脫完畢時間點之間的所有洗脫樣品，濃縮。

(2)重結晶和結構表征

結晶溶劑體系：正己烷：無水乙醇＝6：1。

把濃縮樣品，用1.5～2ml重結晶溶劑溶解，轉入玻璃樣品瓶，用濾紙封瓶口，在通風櫥下敞開揮發。放置過夜后瓶底出現結晶及黃色油狀物(瓶內需留有一定量液體，不可揮干)，用毛細管吸出油狀物，加入溶劑，超聲溶解后繼續揮發，重復2～3次該過程可得到形態較好的晶體。tlc薄層色譜進一步檢測確認所獲的樣品為合成產物純品，取部分晶體樣品進行質譜(lc-ms)分析和單晶衍生分析。表征結果確認吲哚基團已引入苦參堿13鍵位，并獲得目標衍生物(ⅱ)。目標衍生物(ⅱ)的晶體形態見附圖1所示，ms分析結果見圖2所示，單晶衍生結果見表1和圖3所示。

表1數據收集與處理

實施例2環己胺基苦參堿(cyc-mat)制備

s11.制備粗產品

50ml單口燒瓶，加入槐果堿0.62g，環己胺0.55ml，水4ml，磁力攪拌下恒溫60℃油浴加熱6小時。反應結束后，稍冷卻，加入10ml二氯甲烷，攪拌后過濾，濾液蒸去溶劑后得粗產品。

s12.分離純化和結構表征

將步驟s11所得粗產品采用硅膠柱層析法。

(1)分離條件

固定相：200～300目硅膠230ml；

篩選洗脫體系：tlc法篩選洗脫溶劑體系，最后確定柱色譜分離流動相為乙酸乙酯：乙醇＝1：8。

裝柱與活化：濕法裝柱完成后，反復用流動相過柱活化；封口，流動相浸泡靜置過夜。

進樣與洗脫：使用少量洗脫劑溶解試樣后上樣，樣品完全滲入硅膠柱后，加入洗脫劑開始洗脫。每流出5ml餾分收集一次，蒸去大部分溶劑后用于檢測。

檢測：tlc薄層色譜跟蹤檢測分析分離液中目標產物的開始流出時間和洗脫劑體積，目標物洗脫完畢時間和洗脫溶劑體積。合并目標產物開始流出和洗脫完畢時間點之間的所有洗脫樣品，濃縮。

(2)重結晶和結構表征

結晶溶劑體系：石油醚

把濃縮樣品，用1.5～2ml石油醚溶解，轉入玻璃樣品瓶，用濾紙封瓶口，在通風櫥中常溫揮發掉溶劑得到晶體。tlc薄層色譜進一步檢測確認所獲的樣品為合成產物純品，取部分晶體樣品進行lc-ms分析和單晶衍生分析。確認吲哚基團已引入苦參堿13鍵位，并獲得目標衍生物ⅲ。衍生物ⅲ的晶體形態見圖5所示，單晶衍生結果見表2和圖4所示。

表2:數據收集與處理

實施例3本發明兩個衍生物生物活性分析

1.兩個衍生物對腫瘤hela229細胞抑制活性實驗

(1)實驗方案：

試驗化合物：修飾前的先導化合物苦參堿(mat)；合成實驗原料，苦參堿衍生物槐果堿(sop)；本發明兩種新的苦參堿衍生物吲哚基苦參堿(衍生物ⅱind-mat)和環己胺基苦參堿(衍生物ⅲcyc-mat)。

細胞培養：供試的人宮頸癌細胞hela229，以mem基礎培養基加10％胎牛血清，在5％二氧化碳，37℃及適當濕度的細胞培養箱常規培養。

mtt檢測細胞活力：選擇狀態良好的細胞，調整細胞懸液密度至8×10⁴～1×10⁵個/ml，以每孔100μl接種到96孔板中，mat等藥物對細胞增殖的影響，則接種24h后，實驗分兩組：對照組和加藥處理組，設置24、48、72h三個時間點，每組每個時間點各濃度四個重復，到時間點后，向對應的孔，以每孔10μl加入mtt溶液，期間注意避光，于培養箱培養4h后棄去培養液，以每孔150μl加dmso，室溫下輕輕震蕩是藍紫色結晶甲瓚完全溶解，約15min；將96孔放到酶標儀中，設定波長為429mm，測定并記錄對應孔的吸光度(od值)。細胞抑制率(％)＝(1-od實驗組/od對照組)×100％。

倒置相差顯微鏡(ipcm)形態觀察：選擇形態良好的細胞，調整細胞密度至8×10⁴～1×10⁵個/ml，向6孔板中以每孔1ml加入稀釋后的細胞懸液，24h后按照實驗設計，加藥處理，分別在0、24、48、72h進行ipcm定點觀察，拍下照片記錄細胞形態。

(2)結果與分析

由ipcm顯微特征觀察可知，對照組細胞形態呈梭行，折光性好，24、48h均處于旺盛的增殖狀態(圖6-a，b)。分別以終濃度1.6、0.64、1.6mmol/l的mat、ind-mat和cyc-mat誘導細胞24和48h，與對照組比較，三處理細胞形態發生不同程度變化，其中ind-mat和cyc-mat處理組，細胞形態變化尤為顯著，細胞數量逐漸變少，貼壁細胞形態變小，最后解體消失(圖6-e，f，g，h)。mat處理組細胞形態有一定的影響，但變化程度沒有ind-mat和cyc-mat處理組顯著，細胞仍能繼續增殖生長(圖6-c，d)。mtt細胞活力分析表明0.32～0.64mmol/lind-mat對腫瘤細胞有不同程度的抑制作用，并表現出明顯時效性，在相同濃度下cyc-mat對細胞的抑制作用隨時間的增大而增強；在相同作用時間內隨濃度的增加而增強，0.64mmol/l，處理72h抑制率可達83.83％，比0.8mmol/l濃度mat和sop處理組的7.91％和14.46％大幅度增加(見表3、4、5所示)。0.8～1.6mmol/lcyc-mat對腫瘤細胞也有不同程度的抑制作用，并表現出明顯時效性，在相同濃度下cyc-mat對細胞的抑制作用隨時間的增大而增強；在相同作用時間內隨濃度的增加而增強，0.8mmol/l，處理72h抑制率可達66.32％，比相同濃度sop、mat處理組的7.91％和14.46％大幅度增加(表3、4、6)，可見在苦參堿13鍵位上引入吲哚和環己胺兩個雜環，能夠顯著提高其抗腫瘤活性。圖6中，a-b：ck,24h和48h；c-d:2.5mmol/lmatrine處理24h和48h；e-f:2.5mmol/lind-mat處理24h和48h；g-h：1.2mmol/lcyc-mat處理24h和48h。

表3不同濃度mat對腫瘤細胞生長影響

表4不同濃度的sop對腫瘤細胞生長影響

表5不同濃度的ind-mat對腫瘤細胞生長影響

表6不同濃度的cyc-mat對腫瘤細胞生長影響

實施例4本發明兩個衍生物對昆蟲細胞sf9抑制活性

(1)實驗方案：

本發明兩個衍生物多種昆蟲細胞具有很好的抑制活性。為免贅述，以下以草地貪夜蛾(s.frugperda)為例進行說明。

試驗化合物：修飾前的先導化合物苦參堿(mat)；合成實驗原料，苦參堿衍生物槐果堿(sop)；本發明兩種新的苦參堿衍生物吲哚基苦參堿(衍生物ⅱind-mat)和環己胺基苦參堿(衍生物ⅲcyc-mat)。

細胞培養：供試昆蟲細胞為草地貪夜蛾(s.frugperda)sf9細胞系，用含10％胎牛血清的昆蟲培養基置于細胞培養箱27℃恒溫常規貼壁培養。細胞培養基主要成分包括grace’s昆蟲干粉培養基(gibco公司)、活胎牛血清，酵母提取物、蛋白胨，水解乳蛋白，細胞傳代培養。

mtt檢測細胞活力：選擇狀態良好的細胞，調整細胞懸液密度至8×10⁴～1×10⁵個/ml，以每孔100μl接種到96孔板中，mat等藥物對細胞增殖的影響，則接種24h后，實驗分兩組：對照組和加藥處理組，設置24、48、72h三個時間點，每組每個時間點各濃度四個重復，到時間點后，向對應的孔，以每孔10μl加入mtt溶液，期間注意避光，于培養箱培養4h后棄去培養液，以每孔150μl加dmso，室溫下輕輕震蕩是藍紫色結晶甲瓚完全溶解，約15min；將96孔放到酶標儀中，設定波長為429mm，測定并記錄對應孔的吸光度(od值)。細胞抑制率(％)＝(1-od實驗組/od對照組)×100％。

倒置相差顯微鏡(ipcm)形態觀察：選擇形態良好的細胞，調整細胞密度至8×10⁴～1×10⁵個/ml，向6孔板中以每孔1ml加入稀釋后的細胞懸液，24h后按照實驗設計，加藥處理，分別在0、24、48、72h進行ipcm定點觀察，拍下照片記錄細胞形態。

(2)結果與分析

由ipcm顯微形態觀察(圖7，a-h)和細胞活性測定(表7～10)結果可知，對照組細胞形態呈圓形，折光性好，24、48h均處于旺盛的增殖狀態(圖7，a，b)，濃度3mm以下mat和sop對sf9細胞生長有一定促進作用，細胞狀態良好(圖7，c，d)，3～4.5mm對細胞表現一定增殖抑制作用，抑制率低于20％。而13鍵位引入吲哚基修飾后的ind-mat在2.5mm的濃度能夠明顯誘導細胞凋亡，誘導24h，細胞出現漂浮，周圍產生大量凋亡小體，表現出顯著凋亡特征，48h后，絕大部分細胞已漂浮、解體死亡(圖7-e，f)，3mm濃度對細胞增殖生長抑制率超過80％。1.2mmcyc-mat對sf9細胞抑制率超過60％，顯微形態觀察發現cyc-mat誘導sf9細胞24h大部分仍細胞貼壁，但出現空泡化，48h后，大部分細胞貼壁原位解體死亡，但細胞周圍未大量出現凋亡小體(圖7-g，h)，cyc-mat誘導sf9細胞發生自噬死亡。可見在苦參堿13鍵位上引入吲哚和環己胺兩個種雜環，能夠顯著提高其昆蟲細胞抑制活性。圖7中，a-b：ck，24h和48h；c-d:2.5mmol/lmatrine處理24h和48h；e-f:2.5mmol/lind-mat處理24h和48h；g-h：1.2mmol/lcyc-mat處理24h和48h。

表7不同濃度的mat對昆蟲細胞的生長影響

表8不同濃度的sop對昆蟲細胞的生長影響

表9ind-mat對昆蟲細胞的生長影響

表10不同濃度的cyc-mat對昆蟲細胞的生長影響