本發明屬于微生物
技術領域：
，具體涉及一種復合微生物制劑及其在鉛污染土壤中的應用。
背景技術：
：近年來，土壤重金屬日趨污染，嚴重威脅著生態平衡、食品安全和人體健康。其中鉛（pb）、鎘（cd）、汞（hg）、砷（as）、鉻（cr）被認為是主要重金屬污染物中的“五毒”。在我國24個省份（及城市）開展的受污染農作物種植地調查中，80％的土壤污染類型為重金屬污染，其中礦冶活動是重金屬污染的主要來源。鉛屬于重金屬的一種，是一種人體的非必需元素，它可影響神經、造血、生殖和發育、內分泌、免疫、骨骼等各類系統和器官。全世界平均每年排放約500萬噸鉛，其中大部分進入土壤，致使世界各國土壤出現不同程度的鉛污染。隨著工農業的發展和含鉛化學物質的廣為應用，鉛在礦產開采、電鍍冶金、廢物處理處置等過程中，大量含鉛污染物進入土壤環境，造成世界范圍內土壤中鉛污染現象普遍存在。鉛對人類健康的危害很大，能對神經、心血管和內分泌等個系統造成危害，甚至危及生命。因此鉛污染土壤的治理及修復受到越來越多的關注。目前土壤鉛污染修復主要修復途徑有三種：物理修復、化學修復和生物修復。物理修復具有徹底、穩定的優點，但實施工程量大、投資費用高，破壞土壤結構，并且還要對換出的污土進行堆放或處理。化學修復雖然簡單易行，見效快，但往往修復劑用量較大，且重金屬元素易活化。生物修復則包括植物修復和微生物修復，其中植物修復雖然標本兼治，但修復周期長，投資大。微生物修復雖然處理費用低、對周邊環境擾動小、不產生二次污染，但合適微生物資源少，修復效果不明顯。技術實現要素：為了克服現有技術中生物修復鉛污染土壤的缺陷，本發明提供了一種復合微生物制劑及其在鉛污染土壤中的應用。本發明是采用如下技術方案實現的一種復合微生物制劑，其按照如下步驟制備而得：將短小芽孢桿菌種子液（1×108cfu/ml）和枯草芽孢桿菌種子液（1×108cfu/ml）按照1-2:2-3的體積比混合，然后按照10%的接種量轉到發酵罐中培養24h，得到短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發酵液；所述發酵罐培養基組分為：按照質量百分比，葡萄糖8%，酵母膏5%，玉米漿3%，尿素0.1%，硫酸亞鐵0.02%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.01%，磷酸氫二鉀0.01%，ph6.5。將短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發酵液、戈登氏菌發酵液、乙酸鈣不動桿菌發酵液、鞘氨醇假單胞菌發酵液以及成晶節桿菌發酵液按照7-10:5-8:3-4:2-3:2-3的體積比混合均勻，得到液體菌劑；戈登氏菌發酵液、乙酸鈣不動桿菌發酵液、鞘氨醇假單胞菌發酵液以及成晶節桿菌發酵液的濃度均控制在1×1010cfu/ml；將小麥秸稈用粉碎機粉碎，然后過100目篩，得到秸稈粉，將秸稈粉和硅藻土按照2:1的質量比混合攪拌均勻得到載體；將液體菌劑添加到兩倍重量的載體中，200rpm攪拌3min，然后進行低溫干燥，干燥溫度為15-20℃，干燥后含水量為6-10％，包裝，即得。短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)cgmccno.7126（cn104152377a）、枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）cgmccno：0954（cn1554744a）、戈登氏菌(gordoniaamicalis)cgmccno.4794（cn102250801a）、乙酸鈣不動桿菌(acinetobactercalcoaceticus)cgmccno.7334（cn103266073a）、鞘氨醇假單胞菌（sphingomonassp．）cgmccno.4589（cn102168054a）、成晶節桿菌(arthrobactercrystallopoietes)atcc15481。本發明所述的菌種均可以從cgmcc和美國模式培養物集存庫（atcc）等商業途徑購買得到。本發明的各菌種發酵培養為本領域的常規培養方式，不是本發明創新點，此處不詳述。本發明取得的有益效果主要包括：本發明微生物制劑中各菌種之間合理配伍，共生協調，互不拮抗，活性高，能夠有效地處理鉛污染土壤；相對于單一發酵方式，混合發酵枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌之間的協同作用使得菌株中sod以及脫氫酶的活性大大提高，提高了處理重金屬的能力；本發明采用硅藻土和秸稈粉作為載體，不僅增強菌株的存活時間及在土壤中的定植能力，對重金屬也有較強的吸附性，還可以為土壤提供養料；本發明利用微生物制劑的修復方法操作簡單易行，修復成本低，環保無污染，可應用于大規模的鉛污染土壤中，應用前景廣闊。具體實施方式為了使本
技術領域：
的人員更好地理解本申請中的技術方案，下面將結合本申請具體實施例，對本申請的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本申請一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本申請中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都應當屬于本發明保護的范圍。實施例1一種復合微生物制劑，其按照如下步驟制備而得：將短小芽孢桿菌種子液（1×108cfu/ml）和枯草芽孢桿菌種子液（1×108cfu/ml）按照1:2的體積比混合，然后按照10%的接種量轉到發酵罐中培養24h，得到短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發酵液；所述發酵罐培養基組分為：按照質量百分比，葡萄糖8%，酵母膏5%，玉米漿3%，尿素0.1%，硫酸亞鐵0.02%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.01%，磷酸氫二鉀0.01%，ph6.5。將短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發酵液、戈登氏菌發酵液、乙酸鈣不動桿菌發酵液、鞘氨醇假單胞菌發酵液以及成晶節桿菌發酵液按照7:5:3:2:2的體積比混合均勻，得到液體菌劑；戈登氏菌發酵液、乙酸鈣不動桿菌發酵液、鞘氨醇假單胞菌發酵液以及成晶節桿菌發酵液的濃度均控制在1×1010cfu/ml；將小麥秸稈用粉碎機粉碎，然后過100目篩，得到秸稈粉，將秸稈粉和硅藻土按照2:1的質量比混合攪拌均勻得到載體；將液體菌劑添加到兩倍重量的載體中，200rpm攪拌3min，然后進行低溫干燥，干燥溫度為20℃，干燥后含水量為7％，包裝，即得。菌株選自以下：短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)cgmccno.7126（可參見cn104152377a）、枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）cgmccno：0954（可參見cn1554744a）、戈登氏菌(gordoniaamicalis)cgmccno.4794（可參見cn102250801a）、乙酸鈣不動桿菌(acinetobactercalcoaceticus)cgmccno.7334（可參見cn103266073a）、鞘氨醇假單胞菌（sphingomonassp．）cgmccno.4589（可參見cn102168054a）、成晶節桿菌(arthrobactercrystallopoietes)atcc15481。實施例2一種復合微生物制劑，其按照如下步驟制備而得：將短小芽孢桿菌種子液（1×108cfu/ml）和枯草芽孢桿菌種子液（1×108cfu/ml）按照2:3的體積比混合，然后按照10%的接種量轉到發酵罐中培養24h，得到短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發酵液；所述發酵罐培養基組分為：按照質量百分比，葡萄糖8%，酵母膏5%，玉米漿3%，尿素0.1%，硫酸亞鐵0.02%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.01%，磷酸氫二鉀0.01%，ph6.5。將短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發酵液、戈登氏菌發酵液、乙酸鈣不動桿菌發酵液、鞘氨醇假單胞菌發酵液以及成晶節桿菌發酵液按照10:8:4:3:3的體積比混合均勻，得到液體菌劑；戈登氏菌發酵液、乙酸鈣不動桿菌發酵液、鞘氨醇假單胞菌發酵液以及成晶節桿菌發酵液的濃度均控制在1×1010cfu/ml；將小麥秸稈用粉碎機粉碎，然后過100目篩，得到秸稈粉，將秸稈粉和硅藻土按照2:1的質量比混合攪拌均勻得到載體；將液體菌劑添加到兩倍重量的載體中，200rpm攪拌3min，然后進行低溫干燥，干燥溫度為15℃，干燥后含水量為9％，包裝，即得。菌株選自以下：短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)cgmccno.7126（cn104152377a）、枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）cgmccno：0954（cn1554744a）、戈登氏菌(gordoniaamicalis)cgmccno.4794（cn102250801a）、乙酸鈣不動桿菌(acinetobactercalcoaceticus)cgmccno.7334（cn103266073a）、鞘氨醇假單胞菌（sphingomonassp．）cgmccno.4589（cn102168054a）、成晶節桿菌(arthrobactercrystallopoietes)atcc15481。實施例3土壤中鉛金屬的去除試驗：樣品選擇：樣品1：含鉛量為400mg/kg；樣品2：含鉛量為200mg/kg；樣品3：含鉛量:100mg/kg；樣品4：含鉛量:50mg/kg。操作流程：將按照上述實施例制備的微生物制劑0.1kg加入到鉛污染土壤樣品100kg中，攪拌均勻，培養7d，保證含水量為20-30％左右。7d后，將土壤在65℃下烘干，準確稱取1g，用bcr連續提取法，提取土壤中可交換態的鉛。步驟如下：準確稱取通過100目篩的風干土壤樣品1g，加40ml0.1mol/l的hac，放在恒溫振蕩器中24±1℃下連續振蕩16h，然后5000rpm下離心15min。取上清液，用icp-aes測定pb2+含量。具體結果見表1。表1組別實施例1組實施例2組樣品112.7515.91樣品24.136.58樣品30.360.72樣品40.230.49結論：本發明微生物制劑適用于處理各種濃度的鉛污染土壤，但是濃度降為100mg/kg以下時，鉛濃度下降效果并不明顯，可以優選在100-400mg/kg濃度時使用。實施例4各菌株的配伍協同除鉛效果：選擇土壤樣本鉛含量為300mg/kg；微生物制劑分別為實施例1組，對照組1（不添加短小芽孢桿菌-枯草芽孢桿菌混合發酵液，其他同實施例1），對照組2（不添加戈登氏菌發酵液，其他同實施例1），對照組3（不添加鞘氨醇假單胞菌發酵液，其他同實施例1），對照組4（短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌采用分開發酵的方式，其他同實施例1）；操作流程同實施例3；具體結果見表2：表2組別實施例1組對照組1對照組2對照組3對照組4鉛濃度（mg/kg）6.0149.827.631.218.7結論：本發明復合微生物制劑中各菌株相互協同，配伍合理，除鉛能力較好，應用前景廣闊。在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。當前第1頁12