一種用于檢測甘蔗宿根矮化病的分子標記及其應用的制作方法

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種采用分子生物學手段檢測致病菌的方法，具體為一種用于檢測甘蔗宿根矮化病的分子標記及其應用。

背景技術：

甘蔗宿根矮化病是世界各植蔗區普遍發生的重要細菌病害。該病由一種木質部限制性病原菌引起。甘蔗染病后蔗株沒有典型的外部癥狀，只有在非常嚴重的情況下才表現出植株矮小、蔗莖變細等外部癥狀，而這些癥狀易與干旱、養分不足等因素造成的生長不良相混淆，單憑肉眼很難從外觀上判斷蔗株是否發病，導致甘蔗宿根矮化病無意識的通過帶病蔗種傳播。因此，對甘蔗宿根矮化病進行快速準確檢測對保障甘蔗安全生產具有重要意義。

甘蔗矮化病的檢測方法經歷了從剖莖檢測法、相差顯微鏡法，到近年的酶聯免疫方法和pcr技術法。前兩種方法的主要缺點是耗時長、敏感性低；酶聯免疫方法則是利用lxx特異性抗體檢測病原菌，但lxx特異性抗體目前沒有商業化，從而限制了該技術對于田間甘蔗宿根矮化病的大量檢測。

近年來，隨著現代分子生物學和分子克隆技術的不斷發展和完善，pcr技術在植物病理檢測領域的應用日漸廣泛，具備特異性強、靈敏度高、快速的pcr技術在甘蔗宿根矮化病檢測中也得到了廣泛應用。但是由于條件限制及病原體產生變異，導致檢測結果不穩定，且難以實現大規模的應用。

技術實現要素：

本發明的目的是：為了克服現有技術的缺陷，獲得一種適用于田間樣品的檢測，且檢測靈敏度和穩定性高于常規檢測的方法，本發明提供了一種用于檢測甘蔗宿根矮化病的分子標記及其應用。

技術方案：一種用于檢測甘蔗宿根矮化病的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

優選的，所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾。

表1分子標記序列

所述的分子標記在制備檢測甘蔗宿根矮化病試劑盒中的應用。

優選的，所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩沖液、mgcl2、雙蒸水。

優選的，所述試劑盒檢測甘蔗宿根矮化病的步驟包括：

(1)取樣：提取甘蔗葉片樣品的基因組dna；

(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；

(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋100～500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；

(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋20～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；

(5)收集第三輪pcr擴增的產物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

優選的，所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。

優選的，所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。

優選的，所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。

優選的，所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。

優選的，所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。

有益效果：(1)本發明所述分子標記具有簡單、快速、準確的優點；(2)本發明所述分子標記更適用于田間甘蔗宿根矮化病的大批量檢測，且重復性好，檢測結果穩定，無假陰性現象的出現；(3)本發明所述分子標記特異性好、檢測靈敏度高。

附圖說明

圖1是實施例1～3檢測結果圖；

其中，m為分子量為2000bp的maker；1為實施例1pcr產物電泳結果；2為實施例2pcr產物電泳結果；3為實施例3pcr產物電泳結果。

具體實施方式

實施例1

一種用于檢測甘蔗宿根矮化病的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾。

所述的分子標記在制備檢測甘蔗宿根矮化病試劑盒中的應用。

所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩沖液、mgcl2、雙蒸水。

所述試劑盒檢測甘蔗宿根矮化病的步驟包括：

(1)取樣：提取甘蔗葉片樣品的基因組dna；

(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；

(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋100倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；

(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；

(5)收集第三輪pcr擴增的產物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法。

所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。

所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。

所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。

所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。

實施例2

一種用于檢測甘蔗宿根矮化病的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾。

所述的分子標記在制備檢測甘蔗宿根矮化病試劑盒中的應用。

所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩沖液、mgcl2、雙蒸水。

所述試劑盒檢測甘蔗宿根矮化病的步驟包括：

(1)取樣：提取甘蔗葉片樣品的基因組dna；

(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；

(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；

(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋60倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；

(5)收集第三輪pcr擴增的產物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是改良ctab法。

所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。

所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。

所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。

所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。

實施例3

一種用于檢測甘蔗宿根矮化病的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾。

所述的分子標記在制備檢測甘蔗宿根矮化病試劑盒中的應用。

所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩沖液、mgcl2、雙蒸水。

所述試劑盒檢測甘蔗宿根矮化病的步驟包括：

(1)取樣：提取甘蔗葉片樣品的基因組dna；

(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；

(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；

(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋20倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；

(5)收集第三輪pcr擴增的產物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是改良ctab法。

所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。

所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。

所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。

所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。

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