本發明涉及酶或微生物的測定或檢驗方法，具體是一種苯扎氯銨溶液微生物限度檢查方法。
背景技術：
苯扎氯銨溶液為氯化二甲基芐基氫胺的混合物，無色或淡黃色的澄清液體，氣芳香，味極苦，振搖時能產生大量泡沫，用于手術前皮膚消毒，粘膜和傷口消毒。
苯扎氯銨為陽離子表面活性劑，廣譜殺菌劑，對革蘭氏陽性細菌作用較強，在制藥工程中作為防腐劑使用。由于苯扎氯銨原料抑菌作用大，在設計微生物限度檢查方法上存在極大的困難。
技術實現要素：
本發明就是為了解決苯扎氯銨原料抑菌作用大，微生物限度檢查困難的問題，所提出的一種苯扎氯銨溶液微生物限度檢查方法。
本發明是按照以下技術方案實現的。
一種苯扎氯銨溶液微生物限度檢查方法，包括以下步驟：
ⅰ.取苯扎氯銨溶液，加入稀釋液，制成1:10供試液；
ⅱ.用無菌吸頭吸取1份供試液，加入到50份稀釋液中，混勻；
ⅲ.先用少量沖洗液潤洗低吸附性濾膜，再采用薄膜過濾法將稀釋后供試液全量過濾，用沖洗液分次沖洗濾膜，每次的沖洗量為總沖洗量的1/16；
ⅳ.同法制備兩張濾膜，分別貼于兩種不同的培養基上，適宜條件培養后，點計菌落數；
ⅴ.陰性對照：采用薄膜過濾法將稀釋液進行過濾，菌面朝上貼于培養基上培養。
所述稀釋液和沖洗液的成分為蛋白胨干粉和吐溫-80，二者的質量份數比為1:1。
所述稀釋液和沖洗液的制備方法為：稱蛋白胨干粉5份、吐溫-805份，溶于1000份水中，調ph使滅菌后的ph值為7.1±0.2，115-121℃高壓滅菌15-30分鐘。
所述總沖洗量為800ml。
所述培養基為胰酪大豆胨瓊脂培養基和沙氏葡萄糖瓊脂培養基；胰酪大豆胨瓊脂培養基于30-35℃培養3天，沙氏葡萄糖瓊脂培養基于20-25℃培養5天。
所述陰性對照稀釋液過濾后，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基上，30-35℃培養3天。
本發明獲得了如下的有益效果。
本發明有效的解決了苯扎氯銨原料抑菌作用大，微生物限度檢查困難的問題。本發明通過前期大量計數方法適用性初篩試驗，確定了稀釋液、沖洗液以及稀釋液、沖洗液的量，且試驗結果以“cfu/ml”計算，提高了檢測結果的準確性。本發明的試驗方法科學，試驗結果準確，填補了苯扎氯銨原料微生物限度檢查方法的空白，具有廣闊的應用前景。
具體實施方式
一、試驗準備：
1．供試品：苯扎氯銨溶液（10%）
2.菌種：
金黃色葡萄球菌（cmcc（b）26003）
銅綠假單胞菌（cmcc（b）10104）
枯草芽孢桿菌（cmcc（b）63501）
白色念珠菌（cmcc（f）98001）
黑曲霉菌（cmcc（f）98003）
以上標準菌株均購自中國藥品生物制品檢定所或天津市藥品檢驗所。
3．培養基（詳見表1）
4．培養基、沖洗液、中和劑配制方法（詳見表2）
5．試驗儀器（詳見表3）
6.菌懸液的制備：
a.增菌：分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌于胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上，30-35℃恒溫箱培養18-24小時；接種白色念珠菌、黑曲霉菌于沙氏葡萄糖瓊脂培養基中，20-25℃恒溫箱培養，白色念珠菌培養24-48小時，黑曲霉菌5-7天，用3-5ml含0.05%吐溫80的0.9%無菌nacl溶液將黑曲霉孢子洗脫，用管口帶有無菌脫脂棉的毛細管收集孢子懸液于無菌試管中保存，備用。
b.菌液稀釋：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的新鮮培養物用0.9%無菌nacl溶液按10倍稀釋，制成試驗菌液；試驗菌液每毫升含菌量小于100cfu。
c.新制備的菌懸液在室溫條件下應在2小時內使用，2-8℃冷藏可保存24小時。
二、試驗方法的建立
《中國藥典》規定：供試品的微生物計數方法應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產品的微生物計數。
方法適用性試驗需要證明稀釋液、沖洗液本身對試驗菌的生長無影響，并且能夠明顯降低抑菌成分，故需要考察稀釋液、沖洗液的毒性和效力。由于季銨鹽類的苯扎氯銨溶液對革蘭氏陽性菌的殺菌效果明顯，對革蘭氏陰性菌殺傷力較差，且不能殺滅細菌芽孢和真菌孢子，因此選擇金黃色葡萄球菌作為供試液對照組試驗菌株。
1.供試液制備
取苯扎氯銨溶液（10%）10ml，用含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液作為稀釋劑，制成1:10供試液。
2.試驗操作
2.1試驗組
取制備好的供試液10ml加入到500ml含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液中，混勻，加入小于100cfu的菌液。用含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液潤洗濾膜后，將加入菌液的供試液全量過濾，用800ml同一沖洗液分次沖洗，每次50ml/膜。每一試驗菌同法操作。
取下濾膜。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的膜分別貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基上，胰酪大豆胨瓊脂培養基30-35℃培養3天；白色念珠菌、黑曲霉菌的膜各制備2份，分別貼于胰酪大豆胨瓊脂和沙氏葡萄糖瓊脂培養基上。胰酪大豆胨瓊脂培養基30-35℃培養5天，沙氏葡萄糖瓊脂培養基20-25℃培養5天（以下培養條件相同）。
2.2供試液對照組
以制備菌液用的稀釋液代替試驗菌液，同試驗組操作，制備兩膜，分別貼于胰酪胨大豆瓊脂培養基（tsa）和沙氏葡萄糖瓊脂培養基（sda）上，相應溫度培養，測定其本底菌數。
2.3菌液對照組
取10ml不含吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液代替供試液，加到500ml稀釋液中，加入小于100cfu試驗菌液，全量過濾，以測定所加菌懸液生菌數。每一試驗菌同法操作。
2.4中和劑組
取10ml含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液代替供試液，同試驗組操作，每一試驗菌同法操作，以確認其有效性和對微生物的無毒性。
3.方法適用性試驗結果（詳見表4）
4.結論
以上適用性試驗結果表明:各試驗組菌落數回收率（即（試驗組-供試品對照組）菌落數/菌液組菌落數）在0.5-2范圍內；中和劑對照組菌數回收率（中和劑對照組菌落數/菌液組菌落數）在0.5-2范圍內。所以該試驗方法可以用于該供試品的微生物限度檢查。
5.日常微生物限度檢查方法確立
取苯扎氯銨溶液（10%）10ml，加入含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液，制成1:10供試液。用無菌吸頭吸取10ml（相當于供試品1ml苯扎氯銨溶液），加入到500ml含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液中，混勻。先用少量含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白胨水溶液沖洗液潤洗濾膜，再采用薄膜過濾法將供試液全量過濾，用800ml沖洗液分次沖洗，每次50ml。同法制備兩張濾膜，分別貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基中和沙氏葡萄糖瓊脂培養基平皿上，胰酪大豆胨瓊脂皿30-35℃3天培養；沙氏葡萄糖瓊脂皿20-25℃5天培養，點計菌落數。
陰性對照：取稀釋液50ml，過濾，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養皿上，30-35℃培養3天，不得有菌生長。