芝麻SiCOL1和SiCOL2基因及其應用的制作方法

本發明涉及基因工程領域，具體涉及兩個芝麻開花基因及其在植物光周期和開花時間調節中的應用。

背景技術：

芝麻(sesamumindicuml.)隸屬于胡麻科胡麻屬，是一種古老的油料作物，栽培歷史在5000年以上。目前，廣泛分布在南緯40度至北緯45度之間，集中于亞洲和非洲的熱帶、亞熱帶地區。它作為一種營養豐富、功能性強、保健效果好的貴重油料深受人們喜愛。芝麻油不飽和脂肪酸含量高達85％，富含抗氧化、抗癌、降血脂的芝麻素，被譽為“油料皇后”。芝麻為短日照植物，開花主要受光周期調控，不同地區的芝麻開花時間差異很大，可能是受到光周期調控基因影響。

對擬南芥、水稻等植物的研究表明，植物開花的光周期途徑是受到光敏色素、節律鐘、成花素等基因調控，其中一個關鍵基因constans(簡稱co)的變異對植物開花時間調節至關重要。co基因位于生物鐘的輸出途徑，是生物鐘和開花時間基因之間監測日照長度的重要元件，它可以整合光信號和生物鐘信號，節律性地激活floweringlocust的表達，從而誘導開花。co基因編碼的蛋白均包含兩個保守的結構域：靠近氨基端的b-box結構域即鋅指結構域和靠近羧基端的cct結構域。co基因的表達受晝夜節律鐘調控。不同物種中該基因拷貝數不同，co基因不同拷貝之間的功能存在差異。不完全統計，co基因者已經從擬南芥、水稻、玉米、大豆、番茄、葡萄等近二十個物種中克隆得到，但是芝麻光周期調控基因的克隆和功能驗證尚未見報道。

技術實現要素：

本發明的目的是提供芝麻sicol1和sicol2基因及其應用。包括(1)克隆兩個芝麻開花基因sicol1和sicol2；(2)提供基因及其編碼蛋白的序列；(3)提供這兩個基因在育種中的應用，尤其是在調節植物光周期以及開花時間中的應用。

為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明提供一種芝麻sicol1基因，其具有如seqidno.1所示的核苷酸序列或者該序列經替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列，以及芝麻sicol2基因，其具有如seqidno.2所示的核苷酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。

本發明還提供上述芝麻sicol1基因和sicol2基因的蛋白。芝麻sicol1基因的蛋白具有如seqidno.3所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。芝麻sicol2基因的蛋白具有如seqidno.4所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本發明sicol1基因和sicol2基因(全稱sesamumindicumconstanslike1和2)是從芝麻品種“中芝13”中克隆到的兩個基因，sicol1基因和sicol2基因編碼蛋白的氨基酸序列間的同源性為70％，與擬南芥co蛋白的同源性分別為57％和61％。并且sicol1和sicol2蛋白與擬南芥co具有相同的保守結構域：cct結構域和鋅指結構域。其中，cct結構域是開花基因特有的一類結構域。因此，可以推測sicol1和sicol2與擬南芥co基因類似，都具有促進開花的功能。在cct結構域中，芝麻sicol1和sicol2蛋白與擬南芥co蛋白分別存在五個和四個氨基酸的差異；在鋅指結構域中，sicol1蛋白有兩個b-box，而sicol2蛋白的第一個b-box存在缺失。這些結構和序列差異可能導致了芝麻sicol1和sicol2在調控芝麻開花過程中的功能差異。芝麻sicol1和sicol2基因在開花前期和開花期的葉片中表達量最高。芝麻sicol1和sicol2基因受光周期調控，在長、短光照下均呈節律性表達。

本發明包括通過各種方法獲得的如seqidno.1-2所示核苷酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有同等功能的基因。

含有sicol1或sicol2核苷酸序列的克隆載體或各類表達載體、含有所述載體的宿主細胞，含有所述核苷酸序列的轉基因細胞系或重組菌。

上述編碼基因sicol1和sicol2在調節植物光周期和開花時間中的應用。

本發明將sicol1和sicol2基因構建表達載體pbi121，并在大腸桿菌dh5α中擴繁。通過農桿菌介導的蘸花法，將pbi121攜帶的sicol1和sicol2基因轉入擬南芥，獲得擬南芥轉化植株。實驗結果表明，sicol1和sicol2具有增強植物對光周期的敏感性并促進擬南芥開花的作用。

上述技術方案具有如下優點：

1、提供了芝麻sicol1和sicol2基因及其編碼的蛋白本身。

2、過表達sicol1和sicol2基因可改變植物生育期、促進植物開花。過表達芝麻開花基因sicol1和sicol2明顯促進植物(擬南芥)開花，使花期時間縮短，生育期縮短。因而，sicol1和sicol2具有調節花期，可用于解決雜交育種中的花期不遇問題、各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題、光周期敏感問題和引種問題。

附圖說明

圖1是本發明芝麻開花基因sicol1和sicol2編碼蛋白的結構分析；圖1說明：“*”代表該位點的氨基酸序列完全一致，“:”代表該位點的氨基酸序列相似度較高，“.”代表該位點的氨基酸序列相似度較低；

圖2是本發明實施例3的植物表達載體pbi121；

圖3為本發明實施例4的克隆中間載體peasy-t1；

圖4為本發明實施例5的芝麻開花基因sicol1促進擬南芥開花圖；

圖5為本發明實施例6的芝麻開花基因sicol1促進擬南芥開花圖；

圖6為本發明實施例7的芝麻開花基因sicol1促進擬南芥開花圖；

圖7為本發明實施例8的芝麻開花基因sicol2促進擬南芥開花圖；

圖8為本發明實施例9的芝麻開花基因sicol2促進擬南芥開花圖；

圖9為本發明實施例10的芝麻開花基因sicol2促進擬南芥開花圖；

圖10為本發明實施例11的芝麻開花基因sicol1和sicol2在芝麻不同組織的表達水平；

圖11為本發明實施例12的芝麻開花基因sicol1和sicol2在不同時期的芝麻葉片中的表達水平；

圖12為本發明實施例13的芝麻開花基因sicol1和sicol2在長、短日照下的表達水平。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例1：芝麻開花基因sicol1和sicol2的克隆

利用正向引物cccgggatgctgaagctcca(seqidno.5所示)和反向引物gagctctcagaaggacggga(seqidno.6所示)以及正向引物cccgggatgctgaaagtcga(seqidno.7所示)和反向引物gagctctcagaatgatggaa(seqidno.8所示)分別從芝麻品種“中芝13”中克隆。

實施例2：芝麻開花基因sicol1和sicol2所用克隆的中間載體為peasy-t1(見圖3)。

從實施例1中擴增獲得的pcr產物直接按照ta克隆方法克隆到peasy-t1上。將連接產物轉化大腸桿菌dh5α，并在其中擴繁，陽性克隆經過測序篩選獲得sicol1和sicol2，其基因序列如seqidno.1和seqidno.2所示；由其編碼的蛋白質的氨基酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

實施例3：芝麻開花基因sicol1和sicol2編碼蛋白的結構分析

芝麻開花基因sicol1和sicol2基因編碼蛋白的氨基酸序列間的同源性為70％，與擬南芥co蛋白的同源性分別為57％和61％。并且sicol1和sicol2蛋白與擬南芥co具有相同的保守結構域：cct結構域和鋅指結構域。其中，cct結構域是開花基因特有的一類結構域。因此，可以推測sicol1和sicol2與擬南芥co基因具有類似促進開花的功能。在cct結構域中，芝麻sicol1和sicol2蛋白與擬南芥co蛋白分別存在五個和四個氨基酸的差異；在鋅指結構域中，sicol2的第一個b-box存在缺失，這些結構和序列差異可能導致了芝麻sicol1和sicol2在調控開花過程中的功能差異。

實施例4：芝麻開花基因sicol1和sicol2植物表達載體

利用同源重組的方法將芝麻開花基因sicol1和sicol2與圖2所示的pbi121質粒連接，構建芝麻sicol1和sicol2基因的過表達載體。將構建好的載體轉入農桿菌中，再采用蘸花法將農桿菌導入擬南芥中。收集擬南芥的成熟種子(t0代種子)，將t0代擬南芥種子消毒后接種在含卡那霉素的ms篩選培養基上篩選陽性植株。提取陽性植株的葉片dna，分別利用正向引物cgacacttgccgctcag(seqidno.9所示)和反向引物acgacgccctcccatt(seqidno.10所示)以及正向引物atacaactggctttcgt(seqidno.11所示)和反向引物ccattggtgataggga(seqidno.12所示)進行轉基因植株的pcr分子鑒定，確認sicol1和sicol2基因已經轉入的t1代陽性植株。將t1代種子繼續進行卡那霉素篩選，提取陽性植株葉片基因組dna進行pcr分子鑒定，確定t2代陽性植株。

應用實施例：

實施例5：芝麻開花基因sicol1促進擬南芥開花——轉化系ⅰ

從實施例3獲得的t2代陽性擬南芥轉化植株與親本(野生型col-0)在擬南芥生長間中一起培育(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強為120-μmol/m²·s)，直至轉基因植株開花。如圖4所示，其中左圖為轉基因植株，右圖為對照。圖4顯示芝麻開花基因sicol1轉化擬南芥，導致擬南芥對光周期敏感度增強，開花提前1周。說明芝麻sicol1基因具有開花活性，可以促進植物開花。

實施例6：芝麻開花基因sicol1促進擬南芥開花——轉化系ⅱ

從實施例3獲得的t2代陽性擬南芥轉化植株與親本(野生型col-0)在擬南芥生長間中一起培育(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強為120-μmol/m²·s)，直至轉基因植株開花。如圖5所示，其中左圖為轉基因植株，右圖為對照。圖5顯示芝麻開花基因sicol1轉化擬南芥，導致擬南芥對光周期敏感度增強，開花提前1周。說明芝麻sicol1基因具有開花活性，可以促進植物開花。

實施例7：芝麻開花基因sicol1促進擬南芥開花——轉化系ⅲ

從實施例3獲得的t2代陽性擬南芥轉化植株與親本(野生型col-0)在擬南芥生長間中一起培育(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強為120-μmol/m²·s)，直至轉基因植株開花。如圖6所示，其中左圖為轉基因植株，右圖為對照。圖6顯示芝麻開花基因sicol1轉化擬南芥，導致擬南芥對光周期敏感度增強，開花提前1周。說明芝麻sicol1基因具有開花活性，可以促進植物開花。

實施例8：芝麻開花基因sicol2促進擬南芥開花——轉化系ⅰ

從實施例3獲得的t2代陽性擬南芥轉化植株與親本(野生型col-0)在擬南芥生長間中一起培育(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強為120-μmol/m²·s)，直至轉基因植株開花。如圖7所示，其中左圖為轉基因植株，右圖為對照。圖7顯示芝麻開花基因sicol2轉化擬南芥，導致擬南芥對光周期敏感度增強，開花提前1周。說明芝麻sicol2基因具有開花活性，可以促進植物開花。

實施例9：芝麻開花基因sicol2促進擬南芥開花——轉化系ⅱ

從實施例3獲得的t2代陽性擬南芥轉化植株與親本(野生型col-0)在擬南芥生長間中一起培育(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強為120-μmol/m²·s)，直至轉基因植株開花。如圖8所示，其中左圖為轉基因植株，右圖為對照。圖8顯示芝麻開花基因sicol2轉化擬南芥，導致擬南芥對光周期敏感度增強，開花提前1周。說明芝麻sicol2基因具有開花活性，可以促進植物開花。

實施例10：芝麻開花基因sicol2促進擬南芥開花——轉化系ⅲ

從實施例3獲得的t2代陽性擬南芥轉化植株與親本(野生型col-0)在擬南芥生長間中一起培育(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強為120-μmol/m²·s)，直至轉基因植株開花。如圖9所示，其中左圖為轉基因植株，右圖為對照。圖9顯示芝麻開花基因sicol2轉化擬南芥，導致擬南芥對光周期敏感度增強，開花提前1周。說明芝麻sicol2基因具有開花活性，可以促進植物開花。

實施例11：芝麻開花基因sicol1和sicol2在芝麻葉片中表達量較高

以actin7基因作為內參基因，通過實時熒光定量pcr檢測芝麻開花基因sicol1和sicol2在芝麻品種“中芝13”的根、莖、葉、蒴果和種子中的表達。如圖10所示，sicol1和sicol2均在芝麻葉片中高表達。擴增actin7的正向引物和反向引物序列分別為：ggaaccaccactgaggacaat(seqidno.13所示)和acaggagctagaaacagcaaaga(seqidno.14所示)；擴增sicol1的正向引物和反向引物序列分別為：aagcaacgacgataatggga(seqidno.15所示)和ctgacacgaattgtagtaatcaagg(seqidno.16所示)；擴增sicol2的正向引物和反向引物序列分別為：ctccaatccaggtgccgact(seqidno.17所示)和aacatctgctccacttcgact(seqidno.18所示)。

實施例12：芝麻開花基因sicol1和sicol2在現蕾前的芝麻葉片中表達量最高

利用實施例11中的引物，以actin7基因作為內參基因，通過實時熒光定量pcr檢測芝麻開花基因sicol1和sicol2在芝麻品種“中芝13”不同時期葉片中的表達情況，包括播種后14天、21天、28天、30天、33天、36天、38天、40天和50天的芝麻植株。其中，30天和40天分別為芝麻植株出現花蕾和開花的時期。如圖11所示，芝麻sicol1和sicol2基因在播種后28天表達量最高，即現蕾前表達量最高；表明sicol1和sicol2基因可能具有決定芝麻開花的功能。

實施例13：芝麻開花基因sicol1和sicol2在長、短光照條件下節律性表達

利用實施例11中的引物，以actin7基因作為內參基因，通過實時熒光定量pcr檢測芝麻開花基因sicol1和sicol2在長、短光照處理條件下的芝麻品種“中芝13”葉片中的表達水平。短光照處理條件為播種后14天開始每天從8點到17點光照處理9小時，直至開花。長光照處理條件為播種后14天每天從5點到19點光照處理14個小時。如圖12所示，芝麻sicol1和sicol2基因在長、短光照條件下，均在4點表達量最高；芝麻sicol1和sicol2基因在長、短光照條件下，分別在0點和16點表達量最低；表明sicol1和sicol2基因受到光周期調控，呈現晝夜節律表達。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應該視為本發明的保護范圍。

序列表

<110>中國農業科學院油料作物研究所

<120>芝麻sicol1和sicol2基因及其應用

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1065

<212>dna

<213>芝麻(sesamumindicuml.)

<400>1

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