五指毛桃的RPA快速鑒定方法及鑒定用RPA引物與流程

本發明涉及植物類食品或藥材真偽鑒定技術領域，具體涉及一種食藥同源五指毛桃的鑒定方法。

背景技術：

中藥鑒定是中藥研究工作的基礎和前提，直接關系到中藥各項研究工作的結論和臨床療效。其任務是鑒定中藥的真、偽、優、劣，整理中藥復雜品種，尋找和擴大新藥源。傳統的中藥鑒定方法主要包括基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定四大類，各種方法均有其特點和適用對象，有時候還需要幾種方法配合才能完成對一種中藥材的準確鑒定。目前傳統的鑒定方法，存在在不同程度的局限性，如主觀性強、穩定性和重復性差等。近年，dna分子標記技術的興起，為中藥的快速和準確鑒定帶來了新的契機。隨著rflp，rapd，dna條形碼(dnabarcoding)等分子標記技術研究的不斷深入，中藥的質量評價也迎來了一次新的技術革命。雖然這些技術的發展為物種的快速鑒定提供了分子水平的精細分類學標準，使藥材的準確、快速鑒定成為可能，但是dna分子標記技術都涉及到pcr過程：(1)必須依賴熱循環儀(如pcr儀)對解鏈、退火、延伸等過程進行溫度控制(2)實驗操作步驟復雜，擴增時間較長，通常擴增時間需要至少2-3小時，甚至1-2天；(3)對待測物種dna模板質量要求高。因此，探索出一種準確、快速、可靠的鑒別中藥材的方法就非常有必要。

重組酶聚合酶擴增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)技術是近10年發展起來的一種新型的在恒溫下可以使核酸快速擴增的方法。該技術在37℃-39℃恒溫下，利用重組酶可與引物dna緊密結合，形成酶和引物的復合體，當引物在模板dna上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈dna結合蛋白(singlestrandeddnabinding,ssb)的幫助下，使模板dna解鏈，并在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互補鏈。反應產物呈指數級增長，通常在，15min內即完成擴增，整個反應過程無需特殊的輔助儀器(如核酸擴增儀)，對操作人員的要求也不高，具備簡單、節能、快速等特點，因為不需要高溫循環，所以特別適合中藥材大量樣品的快速檢測。目前，rpa技術已廣泛應用于各種病毒、細菌、轉基因物種等方面的檢測，因此該發明技術在中藥材快速鑒別的實踐具有廣闊的應用前景，本發明即采用rpa技術進行五指毛桃快速鑒別。若把該技術引入到法醫鑒定、臨床診斷、海關違禁生物檢測、企業質檢等領域，同樣也具有明顯的實用價值。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種五指毛桃的rpa快速鑒定方法。

本發明一個方面提供一種五指毛桃鑒定的rpa特異性引物組合物，其序列為

上游引物rpa-its-f:5'-tcaaggaaagacaacgagacgatcccagcc-3'seqidno.1

下游引物rpa-its-r:5'-cgactacctgttgccaagacgacgtgacag-3'seqidno.2。

本發明另一個方面提供了提供五指毛桃鑒定方法，其包括如下步驟：

將待測樣品以權利要求1所述的rpa特異性引物組合物進行重組酶聚合酶擴增，檢測擴增產物。

在本發明的技術方案中，待測樣品的制備方法為粉碎樣品后加入提取緩沖液混勻；煮沸后取出，加入0.1mol/ltris–hcl，離心后取上清得到待測樣品。

在本發明的技術方案中，擴增反應的溫度為27℃-52℃，優選為37℃-42℃。

在本發明的技術方案中，擴增反應的時間為15分鐘以上。

在本發明的技術方案中，待測樣品的臨界最低濃度為10^-2ng/μl

本發明另一個方面提供了一種檢測五指毛桃的試劑盒，其包含五指毛桃鑒定的rpa特異性引物組合物，所述五指毛桃鑒定的rpa特異性引物組合物序列為

上游引物rpa-its-f:5'-tcaaggaaagacaacgagacgatcccagcc-3'seqidno.1

下游引物rpa-its-r:5'-cgactacctgttgccaagacgacgtgacag-3'seqidno.2。

本發明再一個方面提供了本發明所述的五指毛桃鑒定的rpa特異性引物組合物在制備鑒定五指毛桃的試劑盒中的用途。

本發明的另一個目的是優化五指毛桃rpa快速鑒定方法的擴增條件。以解決快速、準確、可靠的用rpa技術鑒定五指毛桃的真偽。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

(1)rpa特異性引物設計：一種用于五指毛桃的rpa快速鑒定的特異性引物，其主要特點是上下游引物長度均為30bp，序列如下：

上游引物rpa-its-f:5'-tcaaggaaagacaacgagacgatcccagcc-3'seqidno.1

下游引物rpa-its-r:5'-cgactacctgttgccaagacgacgtgacag-3'seqidno.2

(2)樣品dna的提取

(3)采用步驟(1)設計的特異性引物進行rpa檢測。

步驟(2)具體為：取藥材粉末約5mg，加入pcr管中，加入提取緩沖液(0.5mol/lnaoh,1％pvp和1％tritonx100)20μl，使用漩渦振蕩器振蕩10second混勻；煮沸10second，取出；加入0.1mol/ltris-hcl(ph＝8.0)80μl，輕微漩渦混勻；300×g下離心5min；取上清用于rpa反應。

步驟(3)中，所述rpa鑒定的反應體系為50μl，包括上下游引物(10μm)各2.4μl，rehydrationbuffer29.5μl，dna模板2μl，啟動反應液乙酸鎂(280mm)2.5μl，超純水補至50μl。

步驟(3)中，所述rpa鑒定的反應程序：恒溫37-42℃，15min。

與現有技術相比，本發明的有益效果在于：本發明(1)擺脫了pcr過程中必須依賴熱循環儀(如pcr儀)對解鏈、退火、延伸等過程進行溫度控制，只需在恒溫下(37-42℃)進行擴增反應；(2)實驗操作步驟簡單，擴增時間短(15min)；(3)檢測靈敏度高。本發明提供了一種快速、準確鑒定五指毛桃的方法，為中藥質量控制、臨床用藥安全提供保障，同時為中藥快速、現場鑒別提供新思路以及新方法。該方法也可引入到法醫鑒定、臨床診斷、海關違禁生物檢測、企業質檢等領域，為其提供技術支持，也具有明顯的實際應用價值。

附圖說明

圖1a-圖1b分別為五指毛桃(廣東肇慶鼎湖山樣品wzs-2)rpa反應擴增溫度和擴增時間優化電泳圖

圖1a中泳道1和9為maker，泳道2-7為擴增溫度梯度：22℃,27℃,32℃,37℃,42℃,47℃,52℃。

圖1b中泳道9為maker，泳道1-8為擴增時間梯度：5min,10min,15min,20min,30min,40min,50min,60min。

圖2a-圖2b分別為五指毛桃rpa反應特異性和靈敏度實驗

圖2a為五指毛桃rpa反應特異性實驗圖，其中泳道1和12為maker，泳道2-6為5個不同產地五指毛桃(粗葉榕)樣品：廣東從化(wzs-1)、廣東肇慶鼎湖山(wzs-2)、廣東廣州華南植物園(wzs-3)、廣東梅州大浦(wzs-4)、廣東廣州火爐山(wzs-5)；泳道7-9為極簡榕樣品：海南萬寧(gw-1)、海南定安(gw-2)、海南海口(gw-3)；泳道10-11為鉤吻(斷腸草)樣品：廣東從化(gw-4)、廣東肇慶鼎湖山(gw-5)。

圖2b中為五指毛桃(廣東肇慶鼎湖山樣品wzs-2)rpa反應靈敏度檢測實驗圖，其中泳道8為maker，泳道1-7為樣品濃度梯度：10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。

圖3五個不同產地的10份五指毛桃藥材rpa真偽鑒結果圖

圖3中泳道1和12為maker，泳道2-11分別為5個藥材產地的五指毛桃藥材樣品：福建沙縣(sha-1)、福建沙縣(sha-2)、江西井岡山(jx-1)、江西井岡山(jx-2)、廣東鼎湖山(dhs-1)、廣東鼎湖山(dhs-2)、福建寧德(nd-1)、福建寧德(nd-2)、海南萬寧(wn-1)、海南萬寧(wn-1)。

具體實施方案

以下將參照附圖，對本發明的rpa反應擴增條件、引物的特異性和靈敏度以及市售藥材真偽鑒別進行描述。

實施例1.rpa特異性引物設計

針對植物進化上較不保守的核基因內轉錄間隔區(its)，利用ncbi中核酸序列數據庫，擴增五指毛桃原植物粗葉榕、斷腸草原植物鉤吻的its片段并測序，用mega5.0軟件對全部序列進行比對，尋找粗葉榕its特異性變異位點區域，針對粗葉榕(genebankaccessionno.jq773900)its序列，根據rpa引物設計原則設計一對特異性引物(擴增產物片段大小為412bp)：

上游引物rpa-its-f:5'-tcaaggaaagacaacgagacgatcccagcc-3'seqidno.1

下游引物rpa-its-r:5'-cgactacctgttgccaagacgacgtgacag-3'seqidno.2

實施例2.樣品dna快速提取

取藥材粉末約5mg，加入pcr管中，加入提取緩沖液(0.5mol/lnaoh,1％pvp和1％tritonx100)20μl，使用漩渦振蕩器振蕩10second混勻；煮沸10second，取出；加入0.1mol/ltris-hcl(ph＝8.0)80μl，輕微漩渦混勻；300×g下離心5min；取上清用于rpa反應。

實施例3.五指毛桃rpa快速鑒定的擴增反應條件優化

1)rpa反應擴增溫度優化

擴增反應使用英國twistdx公司生產的twistampbasic試劑盒，根據twistdxmanual按照下述配方配制rpa反應溶液：

將上述試劑加入一個pcr管中，搖勻。將上述的47.5μl反應液移至試劑盒中的反應管中，混勻，使其中的白色狀物體完全混懸。加入2.5μlmg+(280nm)，混勻。反應開始啟動。實驗中使用的模板為樣品wzs-2，設定溫度梯度：22℃,27℃,32℃,37℃,42℃,47℃,52℃，rpa反應時間參考twistdxmanual，設定為40min。待反應完成后進行瓊脂糖(1.5％)電泳檢測。

rpa產物檢測結果如附圖1a：結果顯示，可實現擴增的rpa反應溫度范圍為27℃-52℃，反應的最佳溫度范圍為37℃-42℃。同時rpa反應在常溫(27℃)條件下也可實現擴增(圖1a)。

2)rpa反應擴增時間優化

rpa反應液的配置與(1)相同，在最佳溫度范圍下的實驗條件下(37℃-42℃)，選用38℃作為溫度條件來優化rpa的反應時間。

瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如附圖1b：擴增反應在進行到15分鐘的時候，便出現擴增信號。擴增時間在15分鐘到60分鐘的范圍內均可擴增出單一且穩定的條帶，本實驗表明rpa反應的最短時間是15分鐘(圖1b)。

實施例4.五指毛桃rpa鑒定引物的特異性和靈敏度實驗

1)特異性實驗

對5個不同產地五指毛桃(粗葉榕)5份樣品：廣東從化(wzs-1)、廣東肇慶鼎湖山(wzs-2)、廣東廣州華南植物園(wzs-3)、廣東梅州大浦(wzs-4)、廣東廣州火爐山(wzs-5)；2個產地的極簡榕樣品：海南萬寧(gw-1)、海南定安(gw-2)、海南海口(gw-3)；2個產地的鉤吻(斷腸草)樣品：廣東從化(gw-4)、廣東肇慶鼎湖山(gw-5)共計10個樣品采用快速提取法提取dna，經檢測，10個樣品的dna濃縮范圍為40到50ng/μl，od260/od280值均為1.8左右。以此為模板驗證所設計的rpa引物的特異性。rpa反應液的配置同實施例3中的1)。擴增溫度設定為37℃，擴增時間仍然為40min。

特異性實驗電泳檢測結果如附圖2a，結果顯示，5份五指毛桃樣品出現穩定地陽性擴增，產物大小為412bp。而鉤吻樣品無擴增條帶，說明所設計的rpa引物具有較高的特異性。(圖2a)

2).靈敏度檢測實驗

選取樣品五指毛桃樣品wzs-2的基因組dna作為模板，經紫外分光光度計檢測其起始濃度為46.8ng/μl，對樣品濃度進行稀釋，設置濃度梯度：10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。

靈敏度檢測實驗結果如附圖2b，當把模板原液稀釋至100時(10^-2ng/μl)仍然可以擴增檢測到，這就表明了該rpa實驗臨界濃度最低值是為10^-2ng/μl(圖2b)，實驗也表明rpa反應具有較高的靈敏度。

實施例5.市售五指毛桃藥材樣品的rpa真偽鑒定

采用快速dna提取方法提取來自5個產區的10份五指毛桃藥材：福建沙縣(sha-1)、福建沙縣(sha-2)、江西井岡山(jx-1)、江西井岡山(jx-2)、廣東鼎湖山(dhs-1)、廣東鼎湖山(dhs-2)、福建寧德(nd-1)、福建寧德(nd-2)、海南萬寧(wn-1)、海南萬寧(wn-1)。經紫外分光光度計檢測，樣品濃度為30-50ng/μl，od260/od280值均為1.8左右。以此為模板，進行藥材真偽鑒定。

rpa反應溶液如下：

將上述試劑加入一個pcr管中，搖勻。將上述的47.5μl反應液移至twistampbasic試劑盒反應管中，混勻，使其中的白色狀物體完全混懸。加入2.5μlmg+(280nm)，混勻。反應開始啟動。實驗中使用的擴增條件：擴增溫度38℃，擴增時間為15min。待反應完成后進行瓊脂糖(1.5％)電泳檢測。

市售五指毛桃藥材樣品的rpa真偽鑒定的電泳檢測如附圖3.結果顯示產自5個不同地區的10份藥材全部為正品藥材。這說明利用本實驗所設計的rpa特異性引物及對擴增條件的優化，采用rpa技術并結合dna快速提取法可實現中藥材的快速(20min)鑒定。

sequencelisting

<110>南方醫科大學

<120>五指毛桃的rpa快速鑒定方法及鑒定用rpa引物

<160>2

<170>patentinversion3.3

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