本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種環狀rna的制備方法以及由此制備的環狀多倍串聯rna及其應用。
背景技術：
1、目前環狀rna主要采用體外轉錄的方法，通過配制小體積t7?rna聚合酶轉錄體系，在mg2+等離子的反應環境中從t7啟動子的dna序列開始啟動轉錄。體外轉錄的效率受體系體積、離子濃度、溫度、ph、焦磷酸鹽濃度等因素影響。體外轉錄過程中會產生大量焦磷酸鹽而使rna轉錄產量大大減少，另外還需要保證轉錄體系無rna酶使rna在環合前被降解。因此，轉錄體系中還需增加無機焦磷酸酶去除焦磷酸鹽促進轉錄反應，加入rna酶抑制劑減少rna降解。
技術實現思路
1、為了解決上述至少一個技術問題，本發明公開了一種制備環狀多倍串聯rna正義鏈分子的方法及其用途。該環狀rna正義鏈分子通過體內轉錄的線性rna正義鏈分子的環化產生，所述線性rna正義鏈分子衍生自含有所有必需序列的工程化親本dna模板。如本發明所述的環狀rna正義鏈分子或簡稱環狀rna是通過共價鍵形成的具有連續環狀或近似環狀結構的多核糖核苷酸，其優選包括2～8個串聯重復的正義鏈rna序列，可以結合并遞送多個反義鏈rna，在利用環狀rna穩定性優勢的同時增加正義鏈和反義鏈的結合。本發明的環狀rna具有改善的表達、功能穩定性和免疫原性，并且易于大規模制造。
2、因此，在本發明的第一方面，提供了一種用于制備環狀rna的方法，所述方法包括：使用包含至少一種rna聚合酶啟動子和核酸構建體的表達載體轉化宿主細胞，其中所述核酸構建體按以下順序從5’到3’的方向包括第一環化元件、任選地至少一個第一限制性酶識別序列、至少一個靶序列、任選地至少一個第二限制性酶識別序列和第二環化元件。
3、在一些實施方式中，所述核酸構建體包含2個以上串聯連接的靶序列，例如2～8個，例如2、3、4、5、6、7、8個靶序列。在一些實施方式中，所述核酸構建體包含4個串聯連接的靶序列。在其他實施方式中，所述核酸構建體也可以包含更多個串聯連接的靶序列，例如8～16個，例如8、9、10、11、12、13、114、15、16個靶序列。在包含2個以上靶序列的情況下，優選地，這些靶序列彼此相同。
4、在一些實施方式中，所述靶序列具有18～24個核苷酸的長度，例如18、19、20、21、22、23、24個，優選21個核苷酸的長度。
5、所述第一環化元件和第二環化元件包括與能夠進行rna連接(ligation)的核酸和/或基于蛋白質的系統互補的同源區序列，所述系統選自rna連接dna酶、crispr/dcas9-dnaligase以及內含子-外顯子介導的連接。
6、第一環化元件和第二環化元件經過設計使得能夠通過不同的方法來生產環狀正義鏈rna，包括但不限于dna酶介導的rna環化、crispr-dcas9-連接酶介導的rna環化和自剪接介導的rna環化。
7、目前研究最多的環化策略是自剪接介導的rna環化，其利用內含子核酶自催化剪接反應，基于不同種類的內含子來構建pie(permuted?intron-exon)系統，從而實現rna環化。該系統將天然的內含子、外顯子剪切，置換位置并形成新的內含子-外顯子構建體，在構建體中插入目標序列，轉錄后通過體外反向剪接合成環狀rna。在這一系統中，內含子片段會在自我剪接時掉落，借由兩翼外顯子片段相連完成環化。
8、因此，在一些實施方式中，所述第一環化元件依次包含5’內含子元件和5’外顯子元件，并且所述第二環化元件依次包含3’外顯子元件和3’內含子元件。
9、在一些實施方式中，5’內含子元件和3’內含子元件衍生自相同的自剪接內含子，例如天然自剪接內含子。在一些實施方式中，5’內含子元件衍生自或含有自剪接內含子的5’末端部分，并且因此所述3’內含子元件衍生自或含有自剪接內含子的3’末端部分。在一些實施方式中，5’內含子元件和3’內含子元件的組合保留了自剪接內含子的自剪接活性。
10、在一些實施方式中，所述5’內含子元件包括來自魚腥藻i類內含子，尤其是增強型魚腥藻i類內含子的第一部分，并且所述3’內含子元件包括來自魚腥藻i類內含子，尤其是增強型魚腥藻i類內含子的第二部分。在又一些實施方式中，所述5’內含子元件包括來自t4噬菌體i類內含子，尤其是增強型t4噬菌體i類內含子的第一部分，并且所述3’內含子元件包括來自t4噬菌體i類內含子，尤其是增強型t4噬菌體i類內含子的第二部分。
11、在一些實施方式中，5’外顯子區域衍生自魚腥藻前trna-leu基因的i類內含子的5’天然外顯子。魚腥藻前trna-leu基因的i類內含子的5’天然外顯子包含seq?id?no.5的核苷酸序列。在一些實施方式中，3’外顯子區域衍生自魚腥藻前trna-leu基因的i類內含子的3’天然外顯子。魚腥藻前trna-leu基因的i類內含子的3’天然外顯子包含seq?id?no.12的核苷酸序列。
12、在一些實施方式中，5’外顯子區域衍生自t4噬菌體的td基因的i類內含子的5’天然外顯子。t4噬菌體的td基因的5’天然外顯子包含seq?id?no.52的核苷酸序列。在一些實施方式中，3’外顯子區域衍生自t4噬菌體的td基因的i類內含子的3’天然外顯子。t4噬菌體的td基因的3’天然外顯子包含seq?id?no.54的核苷酸序列。
13、在一些實施方式中，5’外顯子區域衍生自固氮菌屬種bh72的前trna-ile基因的i類內含子的5’天然外顯子。固氮菌bh72的前trna-ile基因的5’天然外顯子包含seq?idno.56的核苷酸序列。在一些實施方式中，3’外顯子區域衍生自固氮菌屬種bh72的前trna-ile基因的i類內含子的3’天然外顯子。固氮菌bh72的pre-trna-ile基因的3’天然外顯子包含seq?id?no.58的核苷酸序列。
14、在一些實施方式中，所述5’內含子元件包含如seq?id?no.4所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。在一些實施方式中，所述5’外顯子元件包含如seq?id?no.5所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。在一些實施方式中，所述3’內含子元件包含如seq?id?no.13所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。在一些實施方式中，所述3’外顯子元件包含如seq?id?no.12所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。
15、在一些實施方式中，所述5’內含子元件包含如seq?id?no.51所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。在一些實施方式中，所述5’外顯子元件包含如seq?id?no.52所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。在一些實施方式中，所述3’內含子元件包含如seq?id?no.53所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。在一些實施方式中，所述3’外顯子元件包含如seq?id?no.54所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。
16、在一些實施方式中，所述5’內含子元件包含如seq?id?no.55所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。在一些實施方式中，所述5’外顯子元件包含如seq?id?no.56所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。在一些實施方式中，所述3’內含子元件包含如seq?id?no.57所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。在一些實施方式中，所述3’外顯子元件包含如seq?id?no.58所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。
17、第一限制性酶識別序列與第二限制性酶識別序列可以相同或不同。在一些實施方式中，第一限制性酶識別序列與第二限制性酶識別序列不同。
18、在一些實施方式中，所述第一限制性酶識別序列與第二限制性酶識別序列中的至少一個選自以下限制性內切酶的識別序列：speⅰ、ageⅰ、hindiii、bgl?ii、kpni、xhoi、sacii、noti、bamhi、xbai。
19、在一些實施方式中，所述第一限制性酶識別序列與第二限制性酶識別序列中的至少一個包含選自以下的序列：a↓ctagt(seq?id?no.14(speⅰ))、a↓ccggt(seq?id?no.15(ageⅰ))、a↓agctt(seq?id?no.39(hindiii))、a↓gatct(seq?id?no.40(bgl?ii))、ggtac↓c(seqid?no.41(kpni))、c↓tcgag(seq?id?no.42(xhoi))、ccgc↓gg(seq?id?no.43(sacii))、gc↓ggccgc(seq?id?no.44(noti))、g↓gatcc(seq?id?no.45(bamhi))、t↓ctaga(seq?id?no.46(xbai))。其中↓表示酶切位點。
20、在所述核酸構建體中插入第一限制性酶識別序列與第二限制性酶識別序列使得能夠容易地將所述至少一個靶序列替換成任意需要的靶序列，例如與治療性rna、sirna或mirna對應的dna多核苷酸序列。
21、如本文所用，術語“間隔區”或“間隔序列”是指將兩個功能性序列彼此物理分離的非功能性序列。在一些實施方式中，所述核酸構建體還包含至少一個間隔序列。在其他實施方式中，所述核酸構建體包含兩個或更多個間隔序列。在一些實施方式中，在所述核酸構建體包含2個以上靶序列的情況下，任意兩個相鄰的靶序列被至少一個間隔序列隔開。
22、在一些實施方式中，所述間隔序列具有2～40個核苷酸的長度，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40個核苷酸的長度。
23、在一些實施方式中，所述間隔序列是polyac序列。在一個實施方式中，所述間隔序列包含約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的polyac含量。在一個實施方式中，所述間隔序列包括約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多嘧啶(c/t或c/u)含量。本文中使用的“polyac”是指由包含腺嘌呤或胞嘧啶的核苷酸組成的多核苷酸或多核苷酸的一部分。
24、在一些實施方式中，所述間隔序列包含以下序列中的任一者或其組合：seq?idnos.7～11所示序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。
25、在一些實施方式中，所述靶序列包含如seq?id?no.2或seq?id?no.6所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。
26、在一些實施方式中，所述宿主細胞選自大腸桿菌細胞，尤其是bl21(de3)感受態細胞。
27、在一些實施方式中，所述方法還包括：使轉化的重組宿主細胞在生長條件下經受溫育，以允許所述表達載體的復制；加入誘導劑誘導所述環狀rna的表達；以及任選地，純化所得環狀rna。
28、在一些實施方式中，所述方法還包括使所述重組宿主細胞擴增的步驟，例如使50ml菌液量擴增至1l菌液量，理論擴增環狀rna量20倍。
29、在一些實施方式中，所述方法包括：在約37℃的溫度下孵育所述重組宿主細胞在合適的培養基中的懸液約3h，然后將所述培養基的體積擴大至少10倍，繼續在約37℃的溫度下孵育所述重組宿主細胞懸液約3h，隨后加入誘導劑進行誘導。
30、在一些實施方式中，所述誘導劑選自異丙基硫代半乳糖苷(iptg)。在一些實施方式中，加入誘導劑進行誘導的步驟在18℃下進行約12～24h，例如約12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h或其間任意值，優選約18h。
31、發明人發現，在18℃下進行長時間的誘導，例如過夜誘導，與更高溫度下(例如37℃)短時間(例如3h)的誘導相比，能夠產生更多的環狀rna。在一些實施方式中，在18℃下誘導18h比在37℃下誘導3h產生至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更多倍的環狀rna。
32、在一些實施方式中，所述至少一種rna聚合酶啟動子衍生自病毒，并且選自t7?rna聚合酶啟動子、sp6?rna聚合酶啟動子、t3?rna聚合酶啟動子、t6?rna聚合酶啟動子、t4?rna聚合酶啟動子和k11?rna聚合酶啟動子。
33、在一些實施方式中，所述表達載體是質粒表達載體，優選大腸桿菌質粒表達載體，例如pet-28a、pet-32a、pgex4t-1、puc57質粒表達載體。
34、在本發明的第二方面，提供了一種環狀rna，其通過根據本發明第一方面的方法制備得到。
35、在一些實施方式中，所述環狀rna包含2個以上串聯連接的正義鏈序列，例如2～8個，例如2、3、4、5、6、7、8個正義鏈序列。在一些實施方式中，所述環狀rna包含4個串聯連接的正義鏈序列。在其他實施方式中，所述環狀rna也可以包含更多個串聯連接的正義鏈序列，例如8～16個，例如8、9、10、11、12、13、114、15、16個正義鏈序列。在包含2個以上正義鏈序列的情況下，優選地，這些正義鏈序列彼此相同，并且/或者任意兩個相鄰的正義鏈序列被至少一個間隔序列隔開。
36、在一些實施方式中，所述間隔序列具有2～40個核苷酸的長度，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40個核苷酸的長度。
37、在一些實施方式中，所述間隔序列是polyac序列。在一個實施方式中，所述間隔序列包含約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的polyac含量。在一個實施方式中，所述間隔序列包括約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多嘧啶(c/t或c/u)含量。本文中使用的“polyac”是指由包含腺嘌呤或胞嘧啶的核苷酸組成的多核苷酸或多核苷酸的一部分。
38、在一些實施方式中，所述間隔序列包含以下序列中的任一者或其組合：seq?idnos.7～11所示序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。
39、在一些實施方式中，所述環狀rna還包含5’外顯子元件和3’外顯子元件，其中所述5’外顯子元件和3’外顯子元件衍生自相同自剪接內含子的天然外顯子，優選地，所述自剪接內含子選自魚腥藻i類內含子、t4噬菌體i類內含子或固氮菌屬種bh72的i類內含子。
40、在一些實施方式中，所述5’外顯子元件和3’外顯子元件共價連接。在一些實施方式中，所述5’外顯子元件的5’端與所述3’外顯子元件的3’端共價連接。在一些實施方式中，所述正義鏈序列具有18～24個核苷酸的長度，例如18、19、20、21、22、23、24個，優選21個核苷酸的長度。
41、在一些實施方式中，所述正義鏈序列包含與seq?id?no.2或seq?id?no.6所示的序列相同的rna序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。
42、在一些實施方式中，所述環狀rna與至少一個線性反義鏈退火形成環狀sirna。在一些實施方式中，所述線性反義鏈具有21～27個核苷酸的長度，例如21、22、23、24、25、26、27個，優選24個核苷酸的長度。
43、在一些實施方式中，所述環狀sirna中反義鏈序列的數量與正義鏈序列的數量相同。在又一些實施方式中，所述環狀sirna中反義鏈序列的數量與正義鏈序列的數量不同，例如少于所述正義鏈序列的數量。
44、在一些實施方式中，所述反義鏈序列包含與seq?id?no.1或seq?id?no.36所示的序列相同的rna序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同一性的序列。
45、在一些實施方式中，所述環狀rna和/或所述至少一個線性反義鏈是未修飾的、部分修飾的或完全修飾的。
46、在一些實施方式中，所述環狀rna和/或所述至少一個線性反義鏈包含至少一個核苷酸修飾。在一些實施方式中，所述至少一種核苷酸修飾是胞苷修飾、尿苷修飾或腺苷修飾。在一些實施方式中，所述至少一個核苷酸修飾選自5-甲基胞嘧啶(m5c)、n6-甲基腺苷(m6a)、假尿苷(ψ)、n1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲氧基尿苷(5mou)。
47、在一些實施方式中，所述環狀rna和/或所述至少一個線性反義鏈還包含至少一種化學修飾。所述化學修飾可包括核苷間鍵合修飾、核堿基修飾、糖修飾或其組合。
48、在一些實施方式中，化學修飾選自lna、ena、hna、cena、2’-o-甲氧基烷基(例如，2’-o-甲氧基甲基、2’-o-甲氧基乙基或2’-o-2-甲氧基丙基)、2’-o-烷基、2’-o-烯丙基、2’-c-烯丙基、2’-氟、2’-脫氧、2’-o-n-甲基乙酰氨基(2’-o-nma)、2’-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-o-dmaeoe)、2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)、2’-ara-f、l-核苷修飾(例如2’-修飾的l-核苷，例如2’-脫氧-l-核苷)、bna消旋糖、消旋環狀烷基和開鏈烷基及其組合。
49、在一些實施方式中，化學修飾是2’-修飾，其選自2’-o-甲基、2’-脫氧、2’-氟及其組合。
50、在一些實施方式中，所有核苷酸的約100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％是經過修飾的，即所述環狀sirna中存在的所有核苷酸的上述比例包含如本文所述的修飾。
51、在一些實施方式中，正義鏈中的所有核苷酸被修飾。在一些實施方式中，正義鏈中的每個核苷酸獨立地用選自2’-o-甲基、2’-脫氧、2’-氟及其組合的2’-修飾修飾。在一些實施方式中，反義鏈中的所有核苷酸都被修飾。在一些實施方式中，反義鏈中的每個核苷酸獨立地用選自2’-o-甲基、2’-脫氧、2’-氟及其組合的2’-修飾修飾。
52、在一些實施方式中，所述環狀sirna中的至少50％的核苷酸獨立地用2’-o-甲基、2’-o-烯丙基、2’-脫氧或2’-氟修飾。
53、在一些實施方式中，所述環狀rna依次包括5’外顯子元件、任選地第一間隔序列、任選地第一限制性酶識別序列、至少一個rna正義鏈序列、任選地第二限制性酶識別序列、任選地第二間隔序列和3’外顯子元件。
54、在本發明的第三方面，提供了一種藥物組合物，其包含根據本發明的第二方面的環狀rna、納米顆粒和任選地，與所述納米顆粒可操作連接的靶向部分。
55、在一些實施方式中，所述納米顆粒是脂質納米顆粒(lnp)、核-殼納米顆粒、可生物降解的納米顆粒、可生物降解的脂質納米顆粒、聚合物納米顆粒、多聚復合物或可生物降解的聚合物納米顆粒。在一些實施方式中，納米顆粒包含一種或多種陽離子脂質、可電離脂質或聚β-氨基酯。在一些實施方式中，納米顆粒包含一種或多種中性脂質。在一些實施方式中，納米顆粒包含一種或多種peg修飾的脂質、聚谷氨酸脂質或透明質酸脂質。在一些實施方式中，納米顆粒包含膽固醇。在一些實施方式中，納米顆粒包含花生四烯酸、白三烯或油酸。在一些實施方式中，lnp除了包含本發明的環狀rna，還包含(i)至少一種可電離脂質；(ii)中性脂質；(iii)膽固醇；以及(iv)peg-脂質，其摩爾比約為20-60％可電離脂質：5-25％中性脂質；25-55％甾醇；0.5-15％peg-脂質。在一些實施方式中，可電離脂質選自alc-0315、n,n-二油酰-n,n-二甲基氯化銨(dodac)、n,n-二硬脂酰-n,n-二甲基溴化銨(ddab)或1,2-二油酰三甲基氯化銨丙烷(dotap)。在一些實施方式中，可電離脂質是alc-0315。在一些實施方式中，中性脂質選自二硬脂酰磷脂酰膽堿(dspc)、二油酰磷脂酰膽堿(dopc)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(popc)、棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(n-馬來酰亞胺甲基)-環己烷-l-羧酸酯(dope-mal)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、或二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)。在一些實施方式中，peg修飾的脂質是dspe-peg、dmg-peg或peg-1。在一些實施方式中，peg修飾的脂質是dspe-peg(2q00)。在一些實施方式中，所述納米顆粒包含以摩爾比計約0.5％至約4％的peg-脂質。在一些實施方式中，可電離脂質：膽固醇：dspc：dmg-peg的摩爾比為50:38:10:1.5。
56、在一些實施方式中，所述環狀rna與至少一個線性反義鏈退火。在一些實施方式中，所述組合物中線性反義鏈與環狀rna的摩爾比選1～8，例如1、2、3、4、5、6、7或8，優選4。
57、在本發明的第四方面，提供了一種疾病治療方法，所述方法包括向有需要的對象給藥治療有效量的根據本發明的第二方面的環狀rna、或根據本發明的第三方面的藥物組合物。
58、所述疾病與靶序列相關。在一些實施方式中，所述藥物介導疾病相關蛋白的mrna的降解，還優選地，所述疾病相關蛋白選自pcsk9、atn1蛋白、共濟失調蛋白、亨廷頓蛋白、bace1。
59、在一個具體實施方式中，所述對象能夠從pcsk9表達量的下調中獲得健康益處。所述對象例如患有代謝疾病。所述代謝疾病選自高甘油三酯血癥、重度高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、家族性高膽固醇血癥、由遺傳條件造成的膽固醇升高、脂肪肝病、非酒精性脂肪肝病(nfld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、血脂障礙、混合型血脂障礙、i型高脂蛋白血癥(其能夠包括3種亞型：ia型，也被稱作伯格-格呂茨綜合征或家族性高乳糜微粒血癥；ib型，也被稱作家族性載脂蛋白cii缺乏癥，和ic型)、v型高脂蛋白血癥、動脈粥樣硬化、冠心病、ii型糖尿病、糖尿病性腎病、糖尿病性神經病、糖尿病性視網膜病、代謝綜合征或心血管疾病。
60、在一個具體實施方式中，所述疾病選自神經變性疾病。
61、在本發明的第五方面，提供了一種重組細胞，所述細胞包含含有至少一種rna聚合酶啟動子和核酸構建體的表達載體，其中所述核酸構建體按以下順序從5’到3’的方向包括第一環化元件、任選地至少一個第一限制性酶識別序列、至少一個靶序列、任選地至少一個第二限制性酶識別序列和第二環化元件。
62、在一些實施方式中，所述細胞選自大腸桿菌(e.coli)細胞，尤其是bl21(de3)感受態細胞。
63、有益效果
64、體外環合效率高：本發明通過在線性rna兩端分別設計經過重排的(pie)ⅰ類內含子及其外顯子序列，在三磷酸鳥苷(gtp)的介導下內含子便可被剪切并被環合，該過程不需要消耗t4?rna連接酶，且耗時較短(僅15分鐘)，更經濟、快速，更有利于體外轉錄體系的擴大。
65、產量高：本發明通過將表達circrna的質粒轉化至大腸桿菌，通過增加大腸桿菌的擴增體系增加circrna模板的拷貝數和表達規模，大大提高了circrna的產量。
66、反義鏈荷載率高：本發明通過制備具有4個重復正義鏈序列串聯的circrna海綿，使其在具備circrna的穩定性的同時能夠結合更多的反義鏈而發揮更出色的體內rna沉默功能。
67、免疫原性低：本發明制備的環狀sirna具有較低的免疫原性。