本發明涉及纖維二糖制備的，具體涉及一種基于蘆竹為原料菌酶協同制備纖維二糖方法及應用。
背景技術：
1、纖維二糖是纖維素的水解產物，是一種由兩分子葡萄糖通過β-1,2-糖苷鍵連接而成的低聚糖，在食品、醫藥及化工等領域具有廣泛的應用前景，因此纖維二糖市場需求量大。我國非糧生物質原料產量大，利用率低。近年來，隨著非糧生物質利用的需求，生物可降解纖維素發展迎來巨量市場需求。
2、蘆竹，是禾本科蘆竹屬的多年草本植物。一般進入12月后收獲，收割時離根莖越近越好，有利于以后的管理。蘆竹桿可通過酶法制備紙漿纖維(cn202410832755.1)，在蘆竹生長到八月份進行青貯可以做成飼料(cn202410682981.6)。正常收割的蘆竹纖維素含量高，可用來制備纖維二糖，原料成本低廉。
3、現有纖維二糖生產方法主要有酸催化葡萄糖脫水、纖維素酶水解和堿催化兩個葡萄糖分子縮合等。其中纖維素酶水解具有環保、高效等優點，由纖維素酶介導的酶水解，是實現纖維素高糖產量和提高生物精煉生產效率和經濟性的關鍵過程，但酶的成本和穩定性是影響其工業化應用的關鍵因素。中國發明專利cn201610057567?.1公開了一種纖維寡糖的生產工藝，將生物質原料通過高能爆碎，將纖維素大分子鏈中的糖苷鍵分子結構打斷，經提取、分離制備不同含量的纖維寡糖，該方法存在溶出率低及純度低的特點。
4、中國發明專利cn201680062329?.8提供了一種含有聚合度3-6的纖維寡糖的制造方法，建立了反應溫度和反應時間的反應關系，利用碳催化劑等，對反應條件進行了優化，但是反應條件復雜，操作方法不簡便。中國發明專利cn201610057255?.0提供了纖維定向二段水解制備纖維寡糖的方法，通過固液分離，有效解除了水解產物的抑制作用，提高了酶的活性和反應效率，但是收獲率仍然不是太高，難以滿足對纖維二糖的收獲率要求。中國發明專利202310175807?.8提供了基于秸稈發酵沼渣的纖維二糖生產方法，通過超聲波處理，破碎了沼渣中的纖維素、增加了酶活性，通過優化反應條件，確定了外切葡聚糖酶活性的計算方法、建立了沼渣反應率的計算方法，但反應過程中仍需用酸，酒精用量大，反應條件復雜且成本較高。
5、纖維二糖和葡萄糖對纖維素酶活的抑制，增加了纖維素酶解時的用酶量、增加了用酶成本，這可能會阻礙生物精煉工藝的經濟可行性，通過酶解制備纖維二糖存在效率低和產物不純的問題。纖維素和半纖維素水解產生大量還原糖，包括纖維二糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖等，野生大腸桿菌可以代謝利用葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖，不能代謝利用纖維二糖(lam,?katie?jing?kay?et?al.?computational?and?structuralbiotechnology?journal?vol.?20?6287-6301.?12?nov.?2022)。
技術實現思路
1、為了實現低成本生產纖維二糖，本發明提供了一種以蘆竹為原料進行纖維二糖高效生產的發酵方法，運用本發明方法，蘆竹原料到纖維二糖的轉化率達到14%以上，纖維二糖的生成濃度達到5?g/l以上，纖維二糖的化學純度高于90%。
2、本發明目的是提供一種以蘆竹為原料酶解產生纖維二糖，大腸桿菌發酵純化纖維二糖的方法，以整株蘆竹為原料酶解制備還原糖，通過大腸桿菌直接代謝非纖維二糖的其他還原糖純化纖維二糖的高效生產技術。
3、為了實現上述目的，本發明提供以下技術方案：
4、一種基于蘆竹為原料菌酶協同制備纖維二糖的方法，其特征在于：該方法包括原料預處理環節、酶解環節、發酵環節和發酵液處理環節，具體步驟如下：
5、s1.將自然干燥后的整株蘆竹進行超微粉碎，得到蘆竹粉，過篩收集超微蘆竹粉；
6、s2.將s1中得到的超微蘆竹粉中加入1~3%?naoh溶液，在溫度為50~60℃的條件下進行熱溶脹，得到蘆竹水解液；
7、s3.向s2中得到的蘆竹水解液中加入商品木聚糖酶（超微蘆竹粉與酶活性比例為1：0.01~0.05），混勻后在30~60℃條件下反應7~10?h，酶解過程中保持酶解液中纖維二糖含量低于5.0?g/l，酶解完成后115℃滅菌20?min得到酶解液；
8、s4.以s3中所得酶解液為碳源進行微生物發酵，培養在35~50℃、通風0~7?vvm、200~900?r/min條件下進行，加氨水維持ph在6.5~7.5；培養時間18~30?h，菌體量od600達到30~60；
9、s5.將s4所得發酵液進行板框過濾，得到沉淀和清液；
10、s6.將s5所得清液過ro膜進行濃縮得到纖維二糖濃縮液；
11、s7.將s6所得纖維二糖濃縮液進行干燥處理后得到高純度纖維二糖。其中
12、s1中所述整株蘆竹包括蘆竹的枝、桿和葉。整株蘆竹超微粉碎是整株蘆竹粉碎后過40~70目篩；
13、s2中所述熱溶脹的體系為料液比=1：2~6，反應溫度為50~60℃，反應時間為4~6?h；s3中超微蘆竹粉與酶活性比例為1：0.01~0.05，在30~60℃條件下反應7~10?h。
14、s3酶解過程中通過稀釋酶解液保持纖維二糖濃度低于5?g/l，減少纖維二糖對酶活的抑制。
15、s4中所述微生物為大腸桿菌，包括但不限于 escherichia?coli?str.?k-12、mg1655、w3110，以及其他大腸桿菌生產菌種，優選 escherichia?coli?str.?k-12。
16、s4中發酵階段培養條件為：35~50℃、通風0~7?vvm、200~900?r/min條件下進行，流加氨水維持ph在6.5~7.5；培養時間18~30?h，菌體量達到od600為30~60。
17、s5中板框過濾將菌體及大顆粒雜質從發酵液中分離，得到含纖維二糖的清液。
18、s6中ro膜允許水分子通過，清液過ro膜可獲得纖維二糖濃縮液，濾過的水經過處理后可重復利用。
19、s7干燥所得纖維二糖化學純度達90%以上。
20、本發明同時也公開了基于整株蘆竹菌酶協同制備纖維二糖方法在用于提高蘆竹轉化率方面的應用。實驗結果顯示：蘆竹原料到纖維二糖的轉化率達到14%以上，纖維二糖的生成濃度達到5?g/l以上，纖維二糖的化學純度高于90%。
21、本發明公開的以蘆竹為原料菌酶協同制備纖維二糖的方法有益效果在于：
22、本發明提供了一種以整株蘆竹為原料進行纖維二糖高效生產的發酵生產方法，運用本發明的方法，蘆竹原料到纖維二糖的轉化率達到14%以上，纖維二糖的生成濃度達到5g/l以上，纖維二糖的化學純度高于90%。可用于以蘆竹為原料或含纖維素的原料高效進行纖維二糖生產，顯著改善了纖維二糖生產的酶活抑制現象，減少了用酶量，節約了用酶成本，實現了低成本制備纖維二糖。