本發明屬于酶工程，具體涉及一種基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法及應用。
背景技術：
1、在現代生物化學工業中，酶作為一種生物催化劑，因其效率高和特異性強被廣泛應用于各種復雜的化學反應。由于游離酶存在穩定性差、回收困難等問題，限制了其在工業化生產中的大規模應用。與游離酶相比，固定化酶具有高穩定性、可重復利用等優勢，在工業生產中具有更強的經濟效益。基于吸附的酶固定化技術是一種簡單的固定化方法，需要的材料和步驟較少，性價比高且易于實施，在大規模的工業生產中，吸附技術往往是酶固定化的首選方法。
2、超薄二維納米材料是一類具有橫向尺寸超過100納米且厚度小于5納米的片層狀納米材料，已經被廣泛應用于生物醫學、靶向治療、生物傳感器、環境修復以及酶的固定化等多個領域。可以設想，單層納米片可以展現出最多活性位點用于生物分子的結合，是一類理想的酶固定化載體。目前為止，單層二維納米材料中氧化石墨烯及其衍生物用于酶的固定化研究最為廣泛。然而，由于氧化石墨烯表面存在含氧官能團（例如，羰基、羧酸、羥基和烷氧基等），其固定化后往往存在酶活性降低的情況。因此，開發用一種新的單層二維納米材料用于酶固定化具有重要的意義。
3、mno2是一種常見的過渡金屬氧化物，不僅性質獨特，而且具有豐富度高、成本低廉和環境友好等特點。已有研究表明，mno2納米片可以作為核酸、藥物和納米探針的載體。單層mno2納米片具有最大的表面積和最小的厚度，有望成為酶固定化的有效載體。雖然其他形態的mno2納米結構，如介孔或空心海膽狀結構已被用于酶固定化，但其存在酶負載量低、酶催化效率低等缺陷。
技術實現思路
1、本發明是為了克服現有的將酶固定在現有單層二維納米材料上時容易致使酶的催化效率降低的缺陷，提供了一種基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法，并將其應用于催化1,3-二氯-2-丙醇合成手性環氧氯丙烷的工藝中。
2、為實現上述發明目的，本發明通過以下技術方案實現：
3、一種基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法，包括以下步驟：
4、（s.1）將十二烷基硫酸鈉溶液和硫酸溶液混合于超純水中并置于油浴中預熱，然后加入高錳酸鉀溶液，充分反應至得到膠體溶液，繼續加熱，得到沉淀物；取沉淀物靜置過夜并洗滌、重新分散于超純水中，得到mno2納米片膠體懸浮液；
5、（s.2）將步驟（s.1）中得到的mno2納米片膠體懸浮液與純化后的鹵醇脫鹵酶溶液混合并調節混合溶液的ph，控溫并振蕩，反應完全后進行離心、洗滌，得到單層mno2納米片固定化的鹵醇脫鹵酶。
6、單層mno2納米片因其化學穩定性好、比表面積大以及生物相容性良好，成為了一種極具潛力的酶固定化載體。mno2納米片表面容易通過物理或化學方法進行功能化，可以通過靜電相互作用、范德華力和氫鍵等多種方式與酶分子進行有效結合，而且其廣泛的比表面積為酶的固定化提供了眾多結合位點。此外，這種材料的層狀結構有助于提高固定化酶的負載量，并為酶提供一個穩定的微環境，從而維持其活性和結構穩定性。
7、因此，本發明提供了一種基于單層二氧化錳納米片的酶固定化方法，以來源于土壤放射桿菌 agrobacterium?radiobacterad1的鹵醇脫鹵酶（hhec）為模式酶，通過單層mno2納米片與酶之間的靜電相互作用、范德華力和氫鍵等多重作用力，實現鹵醇脫鹵酶的高效固定化，顯著提高了酶的負載量和重復利用性，對鹵醇脫鹵酶的工業應用具有重要意義。
8、作為優選，步驟（s.1）中加入的十二烷基硫酸鈉溶液的濃度為50~200?mm；硫酸溶液的濃度為50~200?mm。
9、作為進一步優選，步驟（s.1）中加入的十二烷基硫酸鈉溶液的濃度為100?mm；硫酸溶液的濃度為100?mm。
10、作為優選，步驟（s.1）中加入的超純水的體積為250~300?ml。
11、作為進一步優選，步驟（s.1）中加入的超純水的體積為283.2?ml。
12、作為優選，步驟（s.1）中置于油浴中預熱過程的油浴溫度為90~100?℃，預熱時間為10~30?min。
13、作為進一步優選，步驟（s.1）中置于油浴中預熱過程的油浴溫度為95?℃，預熱時間為20?min。
14、作為優選，步驟（s.1）中加入的高錳酸鉀溶液的濃度為10~100?mm。
15、作為進一步優選，步驟（s.1）中加入的高錳酸鉀溶液的濃度為50?mm。
16、作為優選，步驟（s.2）中加入的mno2納米片膠體懸浮液中含有的mno2納米片的質量濃度為0.1~2?mg/ml。
17、作為進一步優選，步驟（s.2）中加入的體積為1.5?ml的mno2納米片膠體懸浮液中含有的mno2納米片的質量為1.5?mg。
18、作為優選，步驟（s.2）中加入的純化后的鹵醇脫鹵酶溶液的濃度為1~5?mg/ml。
19、作為進一步優選，步驟（s.2）中加入的純化后的鹵醇脫鹵酶溶液的濃度為2?mg/ml。
20、作為優選，步驟（s.2）中調節混合溶液的ph為4~8。
21、作為進一步優選，步驟（s.2）中調節混合溶液的ph為6。
22、作為優選，步驟（s.2）中控溫并振蕩過程的反應溫度為0~10?℃，振蕩速度為500~1000?rpm，反應時間為20~90?min。
23、作為進一步優選，步驟（s.2）中控溫并振蕩過程的反應溫度為4?℃，振蕩速度為800?rpm，反應時間為40?min。
24、如上所述的基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法制備得到的單層mno2納米片固定化的鹵醇脫鹵酶在催化1,3-二氯-2-丙醇合成手性環氧氯丙烷中的應用。
25、本發明以單層二氧化錳納米片（single-layer?mno2nanosheets）和鹵醇脫鹵酶（hhec）作為研究對象，將hhec固定在單層?mno2納米片上，制備出單層mno2納米片固定化的鹵醇脫鹵酶。隨后，將該固定化酶應用于催化1,3-二氯-2-丙醇（1,3-dcp）合成手性環氧氯丙烷（(s)-ech）的反應中。
26、因此，本發明具有以下有益效果：
27、（1）本發明制備了單層mno2納米片，利用單層mno2納米片比表面積大、相容性好的特性，首次將單層mno2納米片用于固定化，開發了一種利用單層mno2納米片固定化酶的新方法；
28、（2）本發明優化了單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的固定化溫度、時間以及固定ph等條件，得到了性能良好的單層mno2納米片固定化的鹵醇脫鹵酶；
29、（3）本發明制備的單層mno2納米片固定化的鹵醇脫鹵酶操作性強、負載率高且重復利用率好，并且可以有效催化1,3-二氯-2-丙醇合成手性環氧氯丙烷。
1.一種基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法，其特征在于，步驟（s.1）中加入的十二烷基硫酸鈉溶液的濃度為50~200?mm；硫酸溶液的濃度為50~200?mm。
3.根據權利要求1所述的一種基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法，其特征在于，步驟（s.1）中加入的超純水的體積為250~300?ml。
4.根據權利要求1所述的一種基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法，其特征在于，步驟（s.1）中置于油浴中預熱過程的油浴溫度為90~100?℃，預熱時間為10~30?min。
5.根據權利要求1所述的一種基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法，其特征在于，步驟（s.1）中加入的高錳酸鉀溶液的濃度為10~100?mm。
6.根據權利要求1所述的一種基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法，其特征在于，步驟（s.2）中加入的mno2納米片膠體懸浮液中含有的mno2納米片的質量濃度為0.1~2mg/ml。
7.根據權利要求1所述的一種基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法，其特征在于，步驟（s.2）中加入的純化后的鹵醇脫鹵酶溶液的濃度為1~5?mg/ml。
8.根據權利要求1所述的一種基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法，其特征在于，步驟（s.2）中調節混合溶液的ph為4~8。
9.根據權利要求1所述的一種基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法，其特征在于，步驟（s.2）中控溫并振蕩過程的反應溫度為0~10?℃，振蕩速度為500~1000?rpm，反應時間為20~90?min。
10.如權利要求1~9中任意一項所述的基于單層mno2納米片固定化鹵醇脫鹵酶的方法制備得到的單層mno2納米片固定化的鹵醇脫鹵酶在催化1,3-二氯-2-丙醇合成手性環氧氯丙烷中的應用。