本發明涉及分子生物學領域中的核酸檢測，尤其涉及一種針對淋球菌的快速核酸恒溫擴增檢測方法。
背景技術：
1、性傳播疾病（stds）是一組以性接觸為主要傳播途徑的疾病。作為一類對人類健康構成嚴重威脅、廣泛流行的傳染病，性傳播疾病不僅對個體健康造成損害，還可能對家庭和社會產生深遠影響。性傳播疾病對人體健康的損害是多維度的。若未能及時發現并徹底治療，感染性傳播疾病可導致生殖器官受損，引發不孕不育，部分疾病甚至可能損害心臟、大腦等重要器官，嚴重時可導致死亡。某些性傳播疾病，例如尖銳濕疣和生殖器皰疹，一旦感染，治愈難度極大。
2、國際上，超過20種通過性行為傳播的感染性疾病被歸類為性傳播疾病。根據世界衛生組織（who）的分類，性傳播疾病分為四個等級，包括一級性病如艾滋病，二級性病如梅毒和淋病，三級性病如尖銳濕疣和生殖器皰疹，以及四級性病如梨形鞭毛蟲病和彎曲桿菌病。二級性傳播疾病主要由淋球菌（neisseria?gonorrhoeae，簡稱ng）、解脲支原體（ureaplasma?urealyticum，簡稱uu）和沙眼衣原體（chlamydia?trachomatis，簡稱ct）等病原體引起。
3、性傳播疾病的傳播速度快，危害性大。淋病，作為性傳播疾病中的一種，全球范圍內廣泛流行，根據美國疾控中心的估計，1997年全球感染淋病的患者約有6200萬人。淋病發病率較高，尤其在性活躍人群中，且在發展中國家發病率更高。淋病的病原體為淋病奈瑟氏菌（ng），人類是其唯一自然宿主。淋球菌一般寄生于黏膜表面的柱狀上皮細胞中，其關鍵的致病成分有菌毛、外膜蛋白、蛋白酶及脂多糖等。淋球菌主要通過性接觸直接感染泌尿生殖道、口咽部和肛門直腸黏膜，或在分娩過程中通過產道感染新生兒。臨床表現多樣，包括單純性淋病、盆腔炎、口咽部和肛門直腸瘺、淋菌性結膜炎及播散性淋病。若未及時治療，可導致尿道狹窄、輸精管及輸卵管狹窄甚至閉鎖，繼發宮外孕和男女不孕不育癥。因此，對淋病的早期診斷和治療至關重要。
4、淋球菌感染后，約1%的男性患者和75%的女性患者無明顯癥狀，因此，僅憑臨床癥狀診斷淋球菌感染的準確性很低，女性尤為如此。目前，主要診斷手段包括涂片檢查、培養檢查和抗原檢測。涂片檢查在淋病潛伏期易漏診，而培養檢查則因程序復雜、耗時長，同樣存在陰性結果的風險。因此，建立準確可靠的檢測方法顯得尤為必要。
5、傳統的淋球菌（ng）檢測方法包括涂片檢測、培養檢測和抗原檢測，每種方法都有其特定的優勢和局限性。為了提升檢測速度，可直接從臨床標本（如尿道拭子、陰道拭子、尿液）中檢測病原體中的核酸，該方法具有快速、準確和高靈敏度等優點，能夠對淋球菌（ng）進行早期診斷，為疫情的快速分析和控制提供有力的技術支持。尤其是核酸恒溫擴增檢測，已成為淋球菌（ng）檢測中最簡便快捷的方法。
6、當前市售的淋球菌檢測套裝普遍面臨操作復雜，需要到中央實驗室統一檢測的問題，亟須進行優化與提升。
7、因此，提供一種可以克服現有淋球菌檢測技術中存在的操作復雜、耗時較長以及檢測準確性不足的缺陷是本發明急需解決的技術問題。
技術實現思路
1、有鑒于此，本發明提供了一種針對淋球菌的快速核酸恒溫擴增檢測方法。
2、為解決上述技術問題，本發明采取了如下技術方案：
3、一種針對淋球菌的快速核酸恒溫擴增檢測方法，包括如下步驟：
4、步驟1：設計淋球菌ngpora引物探針組合
5、選擇ngpora基因作為淋球菌檢測的靶標，對不同淋球菌菌株的ngpora基因序列進行系統比對與分析，并挑選出高度保守的區域作為引物設計的目標序列，進而設計特異性引物。
6、步驟2：設計淋球菌ng?16s引物探針組合
7、對淋球菌不同菌株的ng?16s+23s?核糖核酸基因序列進行比對分析，選取ng?16s+23s?核糖核酸基因中高度保守的區域作為引物設計目標序列，進行特異性引物的設計；
8、步驟3：設計內參基因人源基因（基因組脫氧核糖核酸）引物探針組合
9、選擇人源基因（基因組脫氧核糖核酸）作為內參基因，進行特異性引物的設計；
10、步驟4：設計內參基因人源基因（信使核糖核酸）引物探針組合
11、選擇人源基因（信使核糖核酸）作為內參基因，進行特異性引物的設計；
12、步驟5：快速核酸恒溫擴增檢測體系準備
13、將引物探針混合液進行配制，并進行濃度梯度稀釋。
14、步驟6：進行引物探針靈敏度檢測
15、分別開展淋球菌ngpora引物探針、淋球菌ng?16s引物探針、人源基因?基因組脫氧核糖核酸基因引物探針以及人源基因?信使核糖核酸引物探針的靈敏度檢測。
16、步驟7：對人源基因?基因組脫氧核糖核酸基因引物探針進行數字聚合酶鏈式反應擴增。
17、優選的，所述步驟1中，針對淋球菌ngpora的特異性引物探針組合，該組合由正向引物、反向引物及特異性探針構成，其核苷酸序列分別為：正向引物tatgccggtttccgtgcgttacgatt，反向引物agccggaactggtttcatctgattactttcca，探針gattttccggtttcagcggcagcattcaatt[fam-dt][thf][bhq1-dt]tccgagtcaaaacagc/c3spacer。
18、優選的，所述步驟2中，針對淋球菌ng?16s的特異性引物探針組合，該組合由正向引物、反向引物及特異性探針構成，其核苷酸序列分別為：正向引物tctgaagaaggccttcgggttgtaaagga，反向引物ttccgattaacgctcgcaccctacgtatta，探針ttgtcagggaagaaaaggctgttgccaa[fam-dt][thf][bhq1-dt]cggcggccgatgacggta/c3spacer。
19、優選的，所述步驟3中，針對內參基因人源基因?基因組脫氧核糖核酸的特異性引物探針組合，該組合由正向引物、反向引物及特異性探針構成，其核苷酸序列分別為：正向引物aaagaagtgggtttatggaggtcctcttgtgt，反向引物tcgggtcaacgctaggctggcaggggaa，探針tggaaaaggacatttccaccgcaaaatggcccc[fam-dt][thf][bhq-dt]ggtggtggccccttc(c3spacer)。
20、優選的，所述步驟4中，針對內參基因人源基因?信使核糖核酸的特異性引物探針組合，該組合由正向引物、反向引物及特異性探針構成，其核苷酸序列分別為：正向引物agggctgcttttaactctggtaaagtggat，反向引物tgatgacaagcttcccgttctcagccttga，探針acctcaactacatggtttacatgttccaa[fam-dt](thf)[dt-bhq1]gattccacccatggca(c3spacer)。
21、優選的，所述步驟5中，配制引物探針混合液的方法為：將引物、探針干粉，每分鐘12000轉速，離心1分鐘，根據管壁加水量添加無酶水將引物稀釋至100微摩，再將100微摩原液稀釋至10微摩，上反向引物與探針按照1:1:0.3配制。
22、優選的，所述步驟5中，進行濃度梯度稀釋的條件為：模板保存在零下80℃，常用濃度為10^6拷貝，5微升/支。
23、優選的，所述步驟6和所述步驟7中，恒溫擴增反應條件均為：39℃，30s；60個循環；39℃，30s處收集熒光信號，熒光通道為fam。
24、本發明相對于現有技術取得了以下技術效果：
25、（1）本發明涉及一種淋球菌核酸的快速檢測技術，該技術即便在樣品處理流程簡化的情況下，依然展現出對淋球菌核酸的高度特異性。
26、（2）本發明的檢測方法操作時間短，能夠在數小時內對生殖道分泌物等未知樣本中的淋球菌核酸進行快速且精確的檢測，相較于常規的淋球菌培養和藥敏試驗，大幅縮短了檢測時間。
27、（3）本發明與可經性傳播且能引起類似臨床癥狀的其他病原體無交叉反應，有效解決了現有技術中樣品處理方法煩瑣、試劑盒特異性不足的問題。