專利名稱:用寇氏隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法，具體地說是一種用海洋微藻中的寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Selgo)Javornicky]發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法。
背景技術：
近年來，多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)對人類健康的重要作用已愈來愈受到人們的重視。其中，二十二碳六烯酸因其在人體和動物體內的重要生理功能而倍受人們的青睞。研究表明，DHA是人體某些組織中細胞膜的基本組分；對嬰幼兒視覺系統和神經系統的發育起著重要作用；還具有降低膽固醇作用，抗凝血功效以及抑制癌功效，防止老年性癡呆癥等，并且它是幼魚生長所必需的一種脂肪酸。現在公開報道用海洋微藻生產二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法有兩種。一種是授權公告日為2006年7月19日、授權公告號為CN1264967C的發明專利公開的利用海洋真菌裂殖壺菌發酵生產二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法。另一種是
公開日為1995年4月5日、公開號為CN1101034A的專利申請公開的利用海洋微藻生產二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法。上述兩種方法存在的缺陷在于二十二碳六烯酸(DHA)的產量不高。前一種方法海藻細胞的干重生物量為14-25g/L，菌體中DHA的百分含量為18-35％，后一種方法得到的海藻細胞的干重生物量更低，只有4-8g/L。其原因主要是與所選菌種有關外，還與培養工藝有直接的關系，如采用合適的培養基等。多年來，國內外許多研究者進行了大量的研究篩選不同的菌種，研究采用各種培養工藝均沒有得到理想的結果。
發明內容
本發明的目的就是針對現有技術存在的缺陷，提供一種用海洋微藻中的寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，它大大地提高了二十二碳六烯酸(簡稱DHA)的產量。
本發明的技術方案是這樣實現的它是以寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]為出發菌株，在液體培養基中連續培養寇氏隱甲藻得到海藻細胞，然后從海藻細胞中提取二十二碳六烯酸油脂。本發明所用的寇氏隱甲藻菌種名稱是Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky。可以從包括ATCC(美國典型培養物收集中心)的保藏培養機構獲得。
其中所用的培養基為每100ml液體培養基中含有氯化鈉0.5-2.0g 硫酸鎂0.2-0.8g氯化鈣0.01-0.05g 葡萄糖1.0-10g氯化鉀0.01-0.08g 磷酸二氫鉀0.1-0.5g谷氨酸鈉0.5-5.0g 酵母膏0.5-5.0g維生素B10.001-0.01g 維生素B60.001-0.01g。
優選的培養基配方如下氯化鈉1.8g 硫酸鎂0.55g氯化鈣0.035g 葡萄糖7g氯化鉀0.05g 磷酸二氫鉀0.32g谷氨酸鈉3.8g 酵母膏3.5g維生素B10.006g 維生素B60.008g。
本發明采用斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養和三級發酵培養，得到海藻細胞。其中海藻細胞的生產方法具體步驟如下(1)取出斜面菌種轉接入裝有搖瓶培養基的搖瓶種，25-35℃培養，培養24-72小時。
(2)將步驟1中的搖瓶菌種轉接入裝有搖瓶擴大培養基的搖瓶中進行擴大培養，25-35℃培養，轉速120-180rpm/min，培養30-60小時。
(3)將步驟2中的搖瓶菌種轉接入一個裝有一級種子培養基的發酵罐中，接種量為0.1-1％，保持罐溫25-35℃，罐壓0.05-0.09kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發酵24-48小時。
(4)將一級種子罐中的菌種轉接入一個裝有二級種子培養基的發酵罐中，接種量為1-10％，保持罐溫25-35℃，罐壓0.05-0.09kPa，攪拌速度80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發酵24-48小時。
(5)將二級種子罐種的菌種轉接入一個裝有三級發酵培養基的發酵罐中，接種量為1-10％，保持罐溫25-35℃，罐壓0.05-0.09kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發酵60-120小時。在還原糖含量降低到0.5％以下，氮含量降低至0.02％以下時放罐。放罐后液體使用膜過濾方法，回收海藻細胞。
本發明的提取方法有兩種，一種是將海藻細胞經低溫干燥，然后將干燥菌絲體用有機溶劑浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，將二十二碳六烯酸毛油經堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。另一種是在濃縮發酵液中加入表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉作為破壁劑，其用量為濃縮發酵液重量的0.1-0.6％，然后用有機溶劑浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，將二十二碳六烯酸毛油經脫膠、脫酸、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。其中所述的有機溶劑為正己烷或氯仿等。優選的提取方法是在α-生育酚存在或在惰性氣體如氮氣中，進行從海藻細胞中提取DHA。采用后一種提取方法的優點是不需要經過干燥，可以防止二十二碳六烯酸毛油的氧化，使萃取油脂過氧化值極低，POV值在0.5以下。
本發明所用培養基可含有適當的碳源、氮源、無機鹽。所述的培養基是以葡萄糖或甘油或果糖為碳源，以酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、谷氨酸、玉米漿、大豆蛋白中一種或混合物為氮源。
培養基中用于連續培養的碳源濃度一般優選在1.0到10.0％重量范圍內。
培養基中用于連續培養的氮源濃度可以優選在0.5到5.0％重量范圍內。
對于連續添加的培養基，可以用相對于培養基(I)，用10％(V/V)葡萄糖和2.4％(V/V)酵母浸膏補充到培養基(I)中形成的改良培養基。
本發明選用合適的海洋微藻作為菌種，在培養基中加入了維生素，通過篩選合適的工藝方法，大大提高了二十二碳六烯酸油脂的產量，海藻細胞中二十二碳六烯酸含量在30％-50％，獲得的海藻細胞為20-40g/L，海藻細胞含油量為20-50％。以上各項指標明顯高于現有技術。
具體實施方式
以下通過實施例對本發明作進一步描述實施例1培養基配方(g/100ml)(I)氯化鈉1.25g 氯化鉀0.07g 氯化鈣0.035g硫酸鎂0.8g 磷酸二氫鉀0.2g 谷氨酸鈉4.0g酵母浸膏2.0g 葡萄糖7.5g 維生素B10.003g維生素B60.005g。
加水至所需體積，PH控制在6.5-7.0。
培養基(II)相對于培養基(I)，用10％(V/V)葡萄糖和2.4％(V/V)酵母浸膏補充到培養基(I)中形成的改良培養基。
本發明采用斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養和三級發酵培養，得到海藻細胞。其生產方法具體步驟如下將名稱為Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky的寇氏隱甲藻細胞接種在無菌斜面培養基中，培養溫度為28℃，培養時間48h。
將新鮮的斜面菌種接入裝有100ml培養基的500ml三角瓶中，28℃搖床培養48-72小時，搖床轉速150r/min。然后將所得搖瓶菌種100ml接種到5個三角搖瓶(1000ml)中，每個含200ml培養基(PH6.8)進行擴大培養，28℃搖床培養48小時，搖床轉速150r/min。對以上每個搖瓶做無菌檢測，將反應良好的搖瓶種子接入一級種子罐。
將三角搖瓶擴大的菌種1000ml轉接入裝有60L種子培養基的100L一級種子罐中，保持罐溫28℃，罐壓0.07KPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發酵時間48小時。將一級種子罐菌種轉接入裝有700L種子培養基(PH7.0)的1000L容積的二級種子培養罐中，保持罐溫28℃、罐壓0.07KPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發酵時間36小時。將二級種子罐菌種轉接入裝有30000L三級發酵罐中，保持罐溫28℃、罐壓0.07KPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發酵時間80小時。
本實施例中斜面培養基組成是(g/100ml)葡萄糖5g，酵母浸膏1.2g，瓊脂1.5g，加水定容至100ml。
本實施例中搖瓶培養、搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養、三級發酵培養基均為為培養基(I)。
在發酵開始后，收集樣品，在105℃干燥5h以測量藻細胞密度。當藻細胞的密度達到5g/L時，在與上述罐發酵相同的培養條件下，通過以0.1h/r的稀釋速率連續補充培養基(II)，從而開始連續培養3天。連續培養開始后，在培養基中未發現一個有復鞭毛的藻細胞。(下文將由此得到的藻細胞稱為“連續培養藻細胞”)本實施例中發酵結束標準是發酵液開始變濃，還原糖含量降低到0.5％以下，氮含量降低至0.02％以下，鏡檢發現菌體開始衰老。
將從發酵器中流出的發酵液在105℃干燥5h以找出產率為30.0g/L的干燥細胞和一個油脂生產量為10g/L的干燥藻細胞。
將從發酵器中流出的發酵液經膜過濾濃縮后，低溫干燥，干燥藻細胞用正己烷萃取，得到DHA毛油，DHA毛油經脫膠、脫酸、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。DHA油脂經甲基酯化，用氣相色譜分析確定其含量。
經氣相層析確定的藻細胞中脂肪酸組成如下。
脂肪酸名稱 脂肪酸含量C10:0 0.3532
C12:0 0.1065C14:0 11.0994C16:0 22.39C16:1 0.199C18:0 0.9863C18:1 0.3714C18:2 0.3588C18:4 0.1092C20:4 3.645C20:5 0.4312C22:5 16.17C22:6 43.78實施例2海藻細胞的培養和發酵同實施例1相同。提取方法是將從發酵器中流出的發酵液經膜過濾濃縮后，在濃縮發酵液中加入十二烷基硫酸鈉作為破壁劑，其用量為濃縮發酵液重量的0.1-0.6％，然后用正己烷浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，將二十二碳六烯酸毛油經脫膠、脫酸、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。
DHA精煉油過氧化值為0.1meq/kg，酸價0.14mg(KOH)/g。
DHA油脂經甲基酯化，用氣相色譜分析確定其含量。
經氣相層析確定的藻細胞中脂肪酸組成如下。
脂肪酸名稱 脂肪酸含量C10:0 0.3532C12:0 0.1065C14:0 11.0994C16:0 22.39C16:1 0.199C18:0 0.9863C18:1 0.3714C18:2 0.3588
C18:4 0.1092C20:4 3.645C20:5 0.4312C22:5 16.17C22:6 43.78實施例3培養基(I)氯化鈉1.35g 氯化鉀0.065g 氯化鈣0.04g硫酸鎂0.7g 磷酸二氫鉀0.3g 谷氨酸鈉4.3g酵母浸膏3.0g 葡萄糖8.5g 維生素B10.005g維生素B60.006g加水至100ml培養基(II)相對于培養基(I)，用10％(V/V)葡萄糖和2.4％(V/V)酵母浸膏補充到培養基(I)中形成的改良培養基。
將名稱為Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky的細胞接種在無菌斜面培養基中，培養溫度為28.5℃，培養時間48h。
將新鮮的斜面菌種接入裝有100ml培養基的500ml三角瓶中，28.5℃搖床培養48-72小時，搖床轉速140r/min。然后將所得搖瓶菌種100ml接種到5個三角搖瓶(1000ml)中，每個含200ml培養基(PH6.8)進行擴大培養，28.5℃搖床培養48小時，搖床轉速140r/min。對以上每個搖瓶做無菌檢測，將反應良好的搖瓶種子接入一級種子罐。
將三角搖瓶擴大的菌種1000ml轉接入裝有60L種子培養基的100L一級種子罐中，保持罐溫28.5℃，罐壓0.07KPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發酵時間24小時。將一級種子罐菌種轉接入裝有700L種子培養基(PH7.0)的1000L容積的二級種子培養罐中，保持罐溫28.5℃、罐壓0.07KPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發酵時間28小時。將二級種子罐菌種轉接入裝有30000L培養基的50000L三級發酵罐中，保持罐溫28.5℃、罐壓0.07KPa，攪拌速率110rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發酵時間85小時。
本實施例中斜面培養基組成是(g/100ml)葡萄糖4.8，酵母浸膏1.5，瓊脂1.5，加水定容100ml。
本實施例中搖瓶培養、搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養、三級發酵培養基為培養基(I)。
在發酵開始后，收集樣品，在105℃干燥5h以測量藻細胞密度。當藻細胞的密度達到5g/L時，在與上述罐發酵相同的培養條件下，通過以0.1h/r的稀釋速率連續補充培養基(II)，從而開始連續培養3天。連續培養開始后，在培養基中未發現一個有復鞭毛的藻細胞。
從發酵器中流出的培養基在105℃干燥5h以找出產率為28.0g/L的干燥細胞和一個油脂生產量為7.84g/L的干燥藻細胞。
將從發酵器中流出的發酵液經膜過濾濃縮后，低溫干燥，干燥藻細胞用氯仿萃取，得到DHA毛油，DHA毛油經脫膠、脫酸、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。DHA油脂經甲基酯化，用氣相色譜分析確定其含量。
經氣相層析確定的藻細胞中脂肪酸組成如下。
脂肪酸名稱 脂肪酸含量C10:0 0.4673C12:0 0.4265C14:0 14.0800C16:0 21.6900C16:1 0.1690C18:0 0.9761C18:1 0.6521C18:2 0.3716C18:4 0.1889
C20:4 4.1000C20:5 0.4185C22:5 15.68C22:6 40.78實施例5培養基配方(g/100ml)(I)氯化鈉1.8g 氯化鉀0.05g 氯化鈣0.035g硫酸鎂0.55g 磷酸二氫鉀0.32g 谷氨酸鈉3.8g酵母浸膏3.5g 葡萄糖7.0g 維生素B10.006g維生素B60.008g加水至100ml。
培養基(II)與實施例1相同。
將名稱為Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky的細胞接種在無菌斜面培養基中，培養溫度為28℃，培養時間50h。
將新鮮的斜面菌種接入裝有100ml培養基的500ml三角瓶中，28℃搖床培養48小時，搖床轉速140r/min。然后將所得搖瓶菌種100ml接種到5個三角搖瓶(1000ml)中，每個含200ml培養基(PH6.8)進行擴大培養，28℃搖床培養48小時，搖床轉速140r/min。對以上每個搖瓶做無菌檢測，將反應良好的搖瓶種子接入一級種子罐。
將三角搖瓶擴大的菌種1000ml轉接入裝有60L種子培養基的100L一級種子罐中，保持罐溫28℃，罐壓0.07KPa，攪拌速率120rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發酵時間48小時。將一級種子罐菌種轉接入裝有700L種子培養基(PH7.0)的1000L容積的二級種子培養罐中，保持罐溫28℃、罐壓0.07KPa，攪拌速率120rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發酵時間48小時。將二級種子罐菌種轉接入裝有30000L培養基的50000L三級發酵罐中，保持罐溫28℃、罐壓0.07KPa，攪拌速率120rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發酵時間80小時。
本實施例中斜面培養基組成是(g/100ml)葡萄糖5.5，酵母浸膏2.0，瓊脂1.5，加水定容至所需體積，PH值為自然。
本實施例中搖瓶培養、搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養、三級發酵培養基為培養基(I)。
在發酵開始后，收集樣品，在105℃干燥5h以測量藻細胞密度。當藻細胞的密度達到5g/L時，在與上述罐發酵相同的培養條件下，通過以0.1h/r的稀釋速率連續補充培養基(II)，從而開始連續培養3天。連續培養開始后，在培養基中未發現一個有復鞭毛的藻細胞。
從發酵器中流出的培養基在105℃干燥5h以找出產率為27.0g/L的干燥細胞和一個油脂生產量為7.02g/L的干燥藻細胞。
將從發酵器中流出的發酵液經膜過濾濃縮后，低溫干燥，干燥藻細胞用正己烷萃取，萃取時用α-生育酚作為抗氧化劑在氮氣中進行萃取，得到DHA毛油，DHA毛油經脫膠、脫酸、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。DHA油脂經甲基酯化，用氣相色譜分析確定其含量。
經氣相層析確定的藻細胞中脂肪酸組成如下。
脂肪酸名稱 脂肪酸含量C10:0 0.3800C12:0 0.1240C14:0 11.1174C16:0 22.1200C16:1 0.1625C18:0 0.9156C18:1 0.3485C18:2 0.3927C18:4 0.3892C20:4 5.2475C20:5 0.4326C22:5 18.2300
C22:6 40.1400各種培養基的對比試驗數據如下表1培養基配方設計表
表2發酵液檢查結果表
通過表1、表2可以看出配方1優于其他配方。從而可以得出以下結論同樣發酵條件下，在培養基中添加維生素B1和維生素B6，可提高發酵液中生物量，同時提高藻細胞的含油量。因此，本發明優選配方1的培養基。
權利要求
1.一種用寇氏隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，它是以寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]為出發菌株，在液體培養基中連續培養寇氏隱甲藻得到海藻細胞，然后從海藻細胞中提取二十二碳六烯酸油脂。
2.根據權利要求
1所述的用寇氏隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，其中所用的培養基為每100ml液體培養基中含有氯化鈉0.5-2.0g 硫酸鎂0.2-0.8g氯化鈣0.01-0.05g 葡萄糖1.0-10g氯化鉀0.01-0.08g 磷酸二氫鉀0.1-0.5g谷氨酸鈉0.5-5.0g 酵母膏0.5-5.0g維生素B10.001-0.01g 維生素B60.001-0.01g。
3.根據權利要求
1或2所述的用寇氏隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，其中海藻細胞油脂中二十二碳六烯酸含量在30％-50％。
4.根據權利要求
1或2所述的用寇氏隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，其中三級發酵時間為60h-120h，獲得的海藻細胞為20-40g/L。
5.根據權利要求
1或2所述的用寇氏隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，其中海藻細胞含油量為20-50％。
6.根據權利要求
1或2所述的用寇氏隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，其中它采用斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養和三級發酵培養，得到海藻細胞。
7.根據權利要求
6所述的用寇氏隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，其中海藻細胞的生產方法具體步驟如下(1)取出斜面菌種轉接入裝有搖瓶培養基的搖瓶種，25-35℃培養，培養24-72小時。(2)將步驟1中的搖瓶菌種轉接入裝有搖瓶擴大培養基的搖瓶中進行擴大培養，25-35℃培養，轉速120-180rpm/min，培養30-60小時。(3)將步驟2中的搖瓶菌種轉接入一個裝有一級種子培養基的發酵罐中，接種量為0.1-1％，保持罐溫25-35℃，罐壓0.05-0.09kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量10.3-0.5v/v.m，發酵24-48小時。(4)將一級種子罐中的菌種轉接入一個裝有二級種子培養基的發酵罐中，接種量為1-10％，保持罐溫25-35℃，罐壓0.05-0.09kPa，攪拌速度80-150rpm/min，通氣量10.3-0.5v/v.m，發酵24-48小時。(5)將二級種子罐種的菌種轉接入一個裝有三級發酵培養基的發酵罐中，接種量為1-10％，保持罐溫25-35℃，罐壓0.05-0.09kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量10.3-0.5v/v.m，發酵60-120小時。在還原糖含量降低到0.5％以下，氮含量降低至0.02％以下時放罐。放罐后液體使用膜過濾方法，回收海藻細胞。
8.根據權利要求
1所述的用寇氏隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，其中所述的提取方法是將海藻細胞經低溫干燥，然后將干燥菌絲體用有機溶劑浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，將二十二碳六烯酸毛油經堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。
9.根據權利要求
1所述的用寇氏隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，其中所述的提取方法是在濃縮發酵液中加入破壁劑，其用量為濃縮發酵液重量的0.1-0.6％，然后用有機溶劑浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，將二十二碳六烯酸毛油經脫膠、脫酸、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。
10.根據權利要求
1所述的用寇氏隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，其中所述的有機溶劑為正己烷或氯仿。
專利摘要
本發明涉及一種用海洋微藻中的寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法。它是以寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]為出發菌株，在液體培養基中連續培養寇氏隱甲藻得到海藻細胞，然后從海藻細胞中提取二十二碳六烯酸油脂。本發明選用合適的海洋微藻作為菌種，在培養基中加入了維生素，通過篩選合適的工藝方法，大大提高了二十二碳六烯酸油脂的產量，海藻細胞中二十二碳六烯酸含量在30％－50％，獲得的海藻細胞為20－40g/L，海藻細胞含油量為20－50％。以上各項指標明顯高于現有技術。
文檔編號C12R1/89GKCN1986822SQ200610125476
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月15日
發明者蔡立剛, 袁謙, 簡曉紅 申請人:湖北友芝友生物科技有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan