一種檢測全血或血清樣品中端粒酶的活性程度的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種檢測全血或血清樣品中端粒酶的 活性程度的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 端粒酶是一種由RNA和蛋白質組成的核糖核蛋白復合體，具有逆轉錄酶的活 性。其組分包括端粒酶RNA模板（humantelomeraseRNA，hTR)、端粒酶相關蛋白l(human telomeraseassociatedproteinl,hTEPl)以及端粒酶逆轉錄酶（humantelomerase reversetranscriptase,hTERT)三個部分。研究表明，hTERT是端粒酶的核心，只表達于端 粒酶陽性細胞，并且是端粒酶的限速因子，其mRNA表達水平直接決定端粒酶的活性程度。
[0003] 人類正常體細胞一般無端粒酶活性，而85%?90%的惡性腫瘤可檢出端粒酶活 性。人類細胞在胚胎發育早期，端粒酶呈活化狀態，隨后被抑制并一直處于失活狀態，因而 體細胞通常無端粒酶活性或活性很低。當體細胞發生癌變時端粒酶再度活化，以逃避正常 的細胞衰老過程，獲得無限增殖的潛能。因而，端粒酶再活化是惡性腫瘤一個顯著的生物學 特征。可以通過檢測hTERTmRNA的表達水平來確定端粒酶的活性程度，從而診斷待檢者是 否患有惡性腫瘤。
[0004] 熒光定量PCR是一項通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢 測，從而實現對起始模板進行定量分析的檢測技術。
[0005] 但是，現有技術中這種檢測方法還不完善，存在檢測靈敏度低的缺點，常導致一部 分患者漏診，或者出現"假陽性"，給患者帶來不便。因此，需要建立一種敏感性高、特異性 好、適用面廣的檢測方法。
【發明內容】
[0006] 本發明需要解決的技術問題是，提供一種檢測全血或血清樣品中端粒酶的活性程 度的試劑盒，可以準確檢測待測樣品中端粒酶的活性程度，從而克服現有技術的不足。
[0007] 為解決上述問題，本發明采用如下技術方案：
[0008] 檢測端粒酶hTERTmRNA表達水平的引物，包括如下引物序列：
[0009] (1)端粒酶hTERT基因的引物序列：
[0010] SEQIDN0:l(hTERT-F) :5, -GGCCGATTGTGAACATGGA-3,；
[0011] SEQIDN0:2(hTERT-R) :5' -CCTCTTTTCTCTGCGGAACGT-3'；
[0012] (2)端粒酶hTERT基因的探針序列：
[0013]SEQIDN0:3(hTERT-P) :5'-TACGTCGTGGGAGCCA-3'，且其 5'端與熒光報告基因相 連，3'端與熒光淬滅基因相連。
[0014] 其中，端粒酶hTERT基因的探針序列5'端連接的熒光報告基團為FAM，3'端連接 的熒光淬滅基團為MGB。
[0015] 上述的檢測端粒酶hTERTmRNA表達水平的引物在制備檢測全血或血清樣品中端 粒酶的活性程度的試劑中的應用也在本發明的保護范圍之內。
[0016] 一種檢測全血或血清樣品中端粒酶的活性程度的試劑盒，該試劑盒包括上述端粒 酶hTERT基因的引物（hTERT-F和hTERT-R)和端粒酶hTERT基因的探針（hTERT-P)。
[0017] 其中，該試劑盒還包括如下試劑：總RNA提取試劑、反轉錄試劑、熒光定量PCR反應 試劑、質控品。
[0018] 其中，所述的總RNA提取試劑的包括如下試劑：
[0019] (1)細胞裂解液Trizol:體積分數為56%的重蒸苯酚，28.2g/L的異硫氰酸胍， 14. 9mmol/L檸檬酸鈉溶液，3g/L十二烷基肌氨酸鈉，醋酸鈉112. 7mmol/L，溶劑為雙蒸水；
[0020] ⑵萃取液：氯仿；
[0021] (3)沉淀劑：異丙醇；
[0022] (4)漂洗液：體積分數為75 %的乙醇-;
[0023] (5)RNA溶劑：無RNA酶的水。
[0024] 其中，所述的反轉錄試劑包括如下組分：
[0025] (1)逆轉錄反應緩沖液：250mmol/LTris-cl, 375mmol/LKC1,15mmol/LMgCl2, 50mmol/LDTT,pH8. 3；
[0026] (2)dNTP混合物：10mmol/LdATP，lOmmol/LdlTP，lOmmol/LdCTP，lOmmol/L dGTP；
[0027](3)逆轉錄酶液：20mmol/LTris-cl，200mmol/LNaCl，0?lmmol/LEDTA，1.Ommol/ 1^017，體積分數為50%的甘油，20(^/1^逆轉錄酶，4(^/1^1?隱酶抑制劑4117.5 ;
[0028] (4)引物混合物：寡脫氧胸苷酸引物，隨機6核苷酸引物；
[0029] (5)超純水：電阻18. 2兆歐。
[0030] 其中，所述的熒光定量PCR反應試劑的包括如下組分：
[0031] (l)RT-PCR反應液：10mmol/LdATP，10mmol/LdlTP，10mmol/LdCTP，lOmmol/ LdGTP，25mmol/LMgCl2,5U/iiLTaqDNA聚合酶，lOOmmol/LTris-cl，500mmol/LKC1， 15mmol/LMgCl2,pH8. 5 ；
[0032] (2)超純水：電阻18. 2兆歐。
[0033] 其中，所述的質控品包括如下組分：
[0034] (1)陽性質控品：含端粒酶hTERT基因的重組質粒pGM-hTERT，提取純化濃度為 250mg/mL，拷貝數為 2. 6xl04copies/iiL;
[0035] ⑵陰性質控品：超純水。
[0036] 上述檢測全血或血清樣品中端粒酶的活性程度的試劑盒在制備檢測端粒酶活性 程度試劑中的應用也在本發明的保護范圍之內。
[0037] 有益效果：
[0038] 本發明試劑盒與現有技術相比具有如下優勢：
[0039] 1、本發明試劑盒適用于熒光定量PCR法檢測全血或血清中端粒酶活性程度。
[0040] 2、本發明具有靈敏度高，樣本中端粒酶hTERTmRNA表達水平彡10°copies/iiL時， 均可以檢測到。
[0041] 3、本發明通過制作標準曲線，實現對樣本中端粒酶活性程度的絕對定量。
[0042] 4、本發明檢測只需250iiL樣本，不僅節省樣本，還具有分析時間短，檢測后無需 軟件分析，可直接讀取結果。
【附圖說明】
[0043] 圖1標準曲線擴增圖。
[0044] 圖2標準曲線圖。
[0045] 圖3樣本端粒酶hTERT基因擴增圖。
【具體實施方式】
[0046] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發明。
[0047] 以下實施例所用的主要儀器劑廠家如表1所示。
[0048]表1實驗儀器及廠家
[0049]
【主權項】
1. 檢測端粒酶hTERT mRNA表達水平的引物，其特征在于，包括如下引物序列： (1) 端粒酶hTERT基因的引物序列： hTERT-F :5' -GGCCGATTGTGAACATGGA-3' ； hTERT-R:5' -CCTCTTTTCTCTGCGGAACGT-3' ； (2) 端粒酶hTERT基因的探針序列： hTERT-P :5' -TACGTCGTGGGAGCCA-3'，且其5'端與熒光報告基團相連，3'端與熒光淬滅 基團相連。
2. 根據權利要求1所述的檢測端粒酶hTERT mRNA表達水平的引物，其特征在于，端粒 酶hTERT基因的探針序列5'端連接的熒光報告基團為FAM，3'端連接的熒光淬滅基團為 MGB。
3. 權利要求1所述的檢測端粒酶hTERT mRNA表達水平的引物在制備檢測全血或血清 樣品中端粒酶的活性程度的試劑中的應用。
4. 一種檢測全血或血清樣品中端粒酶的活性程度的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包 含權利要求1?2所述的引物。
5. 根據權利要求4所述的檢測全血或血清樣品中端粒酶的活性程度的試劑盒，其特征 在于，該試劑盒還包括如下試劑：總RNA提取試劑、反轉錄試劑、熒光定量PCR反應試劑、質 控品。
6. 根據權利要求4所述的檢測全血或血清樣品中端粒酶的活性程度的試劑盒，其特征 在于，所述的總RNA提取試劑的包括如下試劑： (1)細胞裂解液Trizol :體積分數為56%的重蒸苯酚，異硫氰酸胍28.2g/L，檸檬酸鈉 溶液14. 9mmol/L，十二烷基肌氨酸鈉3g/L，醋酸鈉112. 7mmol/L，溶劑為雙蒸水； ⑵萃取液：氯仿； (3) 沉淀劑：異丙醇； (4) 漂洗液：體積分數為75%的乙醇； (5) RNA溶劑：無RNA酶的水。
7. 根據權利要求4所述的檢測全血或血清樣品中端粒酶的活性程度的試劑盒，其特征 在于，所述的反轉錄試劑包括如下試劑： (1) 逆轉錄反應緩沖液：250mmol/L Tris-cl, 375mmol/L KC1,15mmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT, pH8. 3 ； (2) dNTP 混合物：10mmol/L dATP，10mmol/L dTTP，10mmol/L dCTP，10mmol/L dGTP; (3)逆轉錄酶液：20mmol/LTris-cl，200mmol/LNaCl，0? lmmol/LEDTA,1. Ommol/L DTT，體積分數為50 %的甘油，200U/ ii L逆轉錄酶，40U/ ii LRNA酶抑制劑，pH7. 5 ; (4) 引物混合物：寡脫氧胸苷酸引物，隨機6核苷酸引物； (5) 超純水：電阻18. 2兆歐。
8. 根據權利要求4所述的檢測全血或血清樣品中端粒酶的活性程度的試劑盒，其特征 在于，所述的突光定量PCR反應試劑的包括如下試劑： (l)RT-PCR 反應液：10mmol/L dATP，10mmol/L dITP，10mmol/L dCTP，10mmol/L dGTP， 25mmol/L MgCl2, 5U/u L TaqDNA 聚合酶，lOOmmol/L Tris-cl, 500mmol/L KC1,15mmol/L MgCl2, pH8. 5 ； (2)超純水：電阻18. 2兆歐。
9. 根據權利要求4所述的檢測全血或血清樣品中端粒酶的活性程度的試劑盒，其特征 在于，所述的質控品包括如下組分： (1) 陽性質控品：含端粒酶hTERT基因的重組質粒pGM-hTERT，提取純化濃度為250mg/ mL，拷貝數為 2. 6xl04copies/ y L ; (2) 陰性質控品：超純水。
10. 權利要求4?9所述的檢測全血或血清樣品中端粒酶的活性程度的試劑盒在制備 檢測端粒酶活性程度試劑中的應用。
【專利摘要】本發明提供了一種檢測全血或血清樣品中端粒酶的活性程度的試劑盒，屬于分子生物學檢測領域，該試劑盒包含如下引物：(1)端粒酶hTERT基因的引物序列：hTERT-F：5’-GGCCGATTGTGAACATGGA-3’；hTERT-R：5’-CCTCTTTTCTCTGCGGAACGT-3’；(2)端粒酶hTERT基因的探針序列：hTERT-P：5’-TACGTCGTGGGAGCCA-3’，且其5’端與熒光報告基因相連，3’端與熒光淬滅基因相連。利用該試劑盒檢測全血或血清樣品中端粒酶的活性程度具有檢測靈敏度高，分析時間短，穩定性好的優點。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104593505
【申請號】CN201510033954
【發明人】趙冬梅, 于嘉屏
【申請人】上海迪安醫學檢驗所有限公司
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月23日