一種抗腫瘤融合蛋白EL-defensin、其編碼基因和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥用蛋白技術領域。具體而言，本發明涉及一種抗腫瘤融合蛋白、其編 碼基因、以該融合蛋白為活性成分的藥物以及其制藥用途。
【背景技術】
[0002] 人的防御素（defensin)由粒細胞和上皮細胞產生，從遺傳學上分為a -防御素和 3-防御素。它們在天然免疫方面主要表現為殺死病原微生物和帶有包膜的病毒，而在獲 得性免疫方面主要表現作為化學誘導劑和激活免疫細胞。a-防御素（HNP1-3)在腫瘤細 胞中超表達，而0 -防御素（HBD)在腫瘤細胞中極少表達，并且最近研究表明hBD-1可以作 為腫瘤的抑制基因。尤其近年來研究表明HBD-1與腫瘤細胞的增殖、分化和轉移有重要的 聯系。例如，誘導前列腺癌細胞中HBD-1的超表達，能夠抑制前列腺癌細胞系DU145和PC3 的增殖，裂解細胞并且啟動caspase蛋白介導的細胞凋亡；HBD-1刺激口腔鱗癌細胞BHY，使 BHY細胞中HBD-3表達量增加，并且抑制細胞的增長；小腸基底HIF-1a是DEFB1能夠表達 所必需的，DEFB1是腸上皮細胞中HIF-la的靶點，而HIF-la的超表達會導致腫瘤的轉移 和腫瘤血管的增生。
[0003] 輔基蛋白（LDP)是力達霉素LDM的蛋白部分，可以通過基因工程的方法制備。先 前報道LDP可以與腫瘤組織特異性結合，其本身在體內也具有中等程度的抗腫瘤作用，并 且物理性質和化學性質比較穩定。因此，LDP以其獨特的分子結構及抗腫瘤特性，可以作為 開發新型抗腫瘤藥物的支架載體。
[0004] 表皮生長因子受體（eipermal growth factor receptor, EGFR)是跨膜受體酪氨 酸激酶家族（ErbB)的一員，其配體有EGF、TGF-a、Amphiregulin、HB-EGF等，配體和受體 結合，進而活化一系列的胞內信號通絡，最終促進細胞的增殖、分化和遷移。EGF是EGFR 的天然配體之一，由53個氨基酸組成，含有6個保守的半胱氨酸殘基，形成3對二硫鍵， Cysl_Cys3形成A環，Cys2_Cys4形成B環，Cys5_Cys6形成C環，EGF與受體結合的區段位 于C環。
[0005] 基于上述，本發明研發了以輔基蛋白LDP為支架的新型抗腫瘤融合蛋白，其具有 EGFR靶向性和防御素HBD-1殺傷腫瘤細胞的功能。
【發明內容】
[0006] 本發明的一個目的是提供一種以LDP為支架具有靶向EGFR的防御素（HBD-1)的 融合蛋白，該融合蛋白為具有抗腫瘤作用的分子量較小的藥用蛋白。
[0007] 本發明的另一個目的是提供該融合蛋白的編碼基因。
[0008] 本發明的還有一個目的是提供以上述融合蛋白為活性成分的藥物以及上述融合 蛋白的制藥用途。
[0009] 本發明通過以下技術方案實現上述目的：
[0010] 迄今為止，在國外文獻報道的相關防御素（defensin)抗腫瘤的研究中，防御素 (defensin)主要是通過真核表達系統獲得的。但是，防御素含有三個二硫鍵，不易可溶性 表達，并且表達量極少，難以獲得高純度的防御素分子。可能是因為防御素分子難以表達， 關于防御素的融合蛋白的報道極少，目前尚無關于防御素的融合蛋白的報道，更沒有將防 御素與具有靶向性的部分或分子相融合的報道。本發明人通過基因工程技術構建了以LDP 為支架的、具有靶向EGFR特異性的防御素（HBD-1)融合蛋白（本文命名為EL-defensin)重 組載體，將其轉化到工程菌BL21star TM(DE3)中表達，并經純化獲得了一種多功能的具有抗 腫瘤作用的藥用蛋白。其中，除表達的蛋白含量外，關于EGFR靶向性，發明人選取了與EGFR 受體結合的EGF重要結構C環，其上22個氨基酸殘基作為導向分子，由此形成的較小分子 的蛋白也更容易穿透組織的細胞外間隙，到達實體腫瘤的深部。
[0011] 因此，一方面，本發明提供一種抗腫瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一級氨基 酸序列結構：
[0012] EGFR特異性靶向寡肽-連接肽1-輔基蛋白LDP-連接肽2-防御素（HBD-1);
[0013] 其中，所述EGFR特異性靶向寡肽具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，共22個氨 基酸；所述輔基蛋白LDP具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，共110個氨基酸；所述防御 素HBD-1具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列，共36個氨基酸。
[0014] 在該融合蛋白中，連接EGFR特異性靶向寡肽與輔基蛋白LDP的連接肽1以及連 接輔基蛋白LDP與防御素HBD1的連接肽2可以相同或不同。優選地，所述連接肽1為 (GGGGS)2，所述連接肽2為（GGGGS) 2。在選擇連接肽時，需考慮如連接肽太短，則剛性大， 不利于蛋白分子伸展，容易造成蛋白分子構想相互遮掩，影響蛋白功能；并且考慮到作為 支架的輔基蛋白LDP共有110個氨基酸，具有a螺旋和0折疊，結構較復雜，因此，選用 (GGGGS)2。
[0015] 優選地，所述融合蛋白具有SEQIDN0:4所示的氨基酸序列；或者，所述融合蛋白 具有SEQIDN0:5所示的氨基酸序列；
[0016] 進一步優選地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示或SEQ ID N0:5。
[0017] SEQ ID N0:4為本發明提供的一個具體融合蛋白的氨基酸序列，共188個氨基 酸。從氨基端至羧基端，該融合蛋白包括：EGFR特異性靶向寡肽（Ec)，共22個氨基酸；連 接肽1，為（GGGGS) 2柔性肽，共10個氨基酸；輔基蛋白LDP，共110個氨基酸；連接肽2,為 (GGGGS)2柔性肽，共10個氨基酸；防御素HBD-1 (HBD-1)，共36個氨基酸。
[0018] SEQ ID N0:5為本發明提供的另一個具體融合蛋白的氨基酸序列，共192個氨基 酸。相比于SEQ ID N0:4,該融合蛋白在EGFR特異性靶向寡肽之前具有Met和Ala，在防御 素的C端具有Leu和Glu。
[0019] 另一方面，本發明提供上述融合蛋白的編碼基因。
[0020] 優選地，所述編碼基因具有SEQ ID N0:6或7所示的核苷酸序列；
[0021] 進一步優選地，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:6或7所示。
[0022] 另一方面，本發明還提供一種抗腫瘤藥物，所述藥物以本發明提供的上述融合蛋 白為活性成分。優選地，所述抗腫瘤藥物用于治療或預防鱗癌、肺癌或胰腺癌，優選肺癌。
[0023] 又一方面，本發明還提供上述融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的用途。優選地，所述 抗腫瘤藥物用于治療或預防鱗癌、肺癌或胰腺癌，優選肺癌。
[0024] 綜上，本發明應用基因工程的方法提供了一種新型的具有殺傷性、靶向性的融合 蛋白。該融合蛋白為靶向EGFR (表皮生長因子受體)、且含有LDP和defensin的新型蛋白。 與現有技術相比，本發明的融合蛋白具有以下實質性區別和效果：
[0025] 在現有技術中，尚無將防御素與其它部分或分子、特別是具有靶向性的部分或分 子相融合形成融合蛋白的報道。其原因可能在于，人的防御素分子HBD-1含有三個二硫鍵， 因此在原核細胞中極其難以表達，且常常以包涵體的形式表達，并且由于其分子空間結構 復雜，其不易和其它蛋白融合表達。
[0026] 而在本發明提供的融合蛋白中，以LDP作為支架，將防御素與EGFR的配體寡肽融 合，其中EGFR的配體寡肽為靶向分子，防御素HBD-1為彈頭，從而構建了一個靶向EGFR的 彈頭小分子藥物。這樣就實現了直接表達獲得包含防御素的蛋白分子。實驗證明，所得到 的融合蛋白不僅保留了 defensin殺傷腫瘤細胞的作用，而且能更特異地靶向腫瘤組織，因 此具有更好的殺傷腫瘤的優點，在動物體內具有良好的抗腫瘤效果，相比于單獨應用各部 分，其技術效果更顯著。并且，即使本領域已有一些將LDP作為支架構建融合蛋白的報道， 但是，現有的此類融合蛋白往往是使LDP起組裝彈頭分子AE的作用，與本發明提供的融合 蛋白具有本質區別，并且往往具有毒性大、無靶向性等缺點。