一種耐重金屬植物根際促生菌新種Burkholderia sp.D414及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于重金屬污染環境的生物修復技術領域，具體涉及一種重金屬（鉛、鎘、 銅、鋅）耐性植物促生菌新種及其應用。
【背景技術】
[0002] 由于人類工業活動導致土壤中重金屬元素含量增加，重金屬元素能夠通過作物吸 收與富集的方式，通過食物鏈最終影響人類健康。植物通過根系從土壤吸收生長必須營養 元素，在重金屬污染土壤中，根系是首先暴露于重金屬脅迫的植物器官，也是最先受重金屬 毒害的植物器官。與此同時，根際土壤中存在著數量和種類豐富的微生物種群，它們與植物 根系以及土壤形成特殊微環境，是根際土壤中最重要的生物因素。研宄發現，植物根際促生 菌能夠產生植物生長激素促進植物生長，改變根際微環境中重金屬元素生物有效性，強化 重金屬污染土壤植物修復效率。因此，分離篩選具有多種重金屬耐受性，促進植物生長的優 良植物根際促生菌新種，并研發相應功能菌劑對于土壤重金屬污染修復具有重要意義。
【發明內容】
[0003] 本發明目的是提供一株具有多重金屬耐受性植物根際促生菌新種Burkholderia sp.D414,以及含有該菌株的植物促生菌劑及其應用。
[0004] 1.本發明從典型重金屬復合污染稻田土壤中分離篩選出具有多種重金屬耐受 性，且具有較強植物促生特性的植物根際促生菌新種D414,分類命名為伯克霍爾德氏菌 屬（Burkholderiasp.D414)。2013年2月05日保藏于布達佩斯條約承認的生物材料樣 品國際保藏單位"DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH， (DSMZ，德國微生物保藏中心）"，地址：LeibnizInstituteDSMZ-GermanCollection ofMicroorganismsandCellCulturesInhoffenstra0e7B38124Braunschweig Germany(德國不倫瑞克市德國萊布尼茨DSMZ微生物和細胞培養物保藏中心，38124)，保藏 號為DSM26823。
[0005] 2.本發明所述耐重金屬植物根際促生菌新種Burkholderiasp.D414,通過梯度稀 釋法分離自典型重金屬復合污染稻田土壤。該菌株對鉛、鎘、銅和鋅多種重金屬具有耐受 性。
[0006] 菌株D414形態特性描述如下：菌體大小為0.5-0. 7X0. 8-2.0ym，革蘭氏陰性， 好氧，如圖 1 所示。在分離培養基（SMN) : (NH4)2S04,Sgl'Mannitol，58112冊04, 0? 5grS MgS04, 0?SgrSNaCl，0?lgl、FeS0 4, 0?OSgl'MnSO4, 0? 05grS瓊脂粉 20gl、去離子水 1000mL;pH6.8±0. 2上形成單菌落呈黃白色，圓形凸起且具有清晰邊緣。菌株D414能夠 在10-50°C范圍生長，其中最適生長溫度為30°C，菌株D414能夠在pH3. 0-8. 0范圍內生長， 最適生長pH為7.0。
[0007] 菌株D414生理生化特征描述如下：菌株D414能夠在無N阿須貝（Ashby's NitrogenFreeMedium)培養基上生長，吲噪陽性，具有脲酶，氧化酶，過氧化氫酶，硝基半 乳糖酶活性，于此同時具有1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC)脫氨酶活性，能夠利用七葉靈， 葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，甘露醇，N-乙酰葡糖胺，蘋果酸酯，葡糖酸鹽，正癸酸，己二酸，檸 檬酸鹽，乙酸苯酯，D-核糖，D-木糖，D-核糖醇，D-果糖，D-鼠李糖，肌醇，山梨醇，水楊苷， D-纖維二糖，D-蜜二糖，D-龍膽二糖，D-來蘇糖，海藻糖，D-阿拉伯醇。菌株D414硝酸鹽 還原反應陰性，明膠水解陰性，不能夠利用精氨酸，赤蘚糖醇，L-木糖，甲基-吡喃型木糖 苷，L-山梨糖，己六醇。苦杏仁苷，熊果苷，D-乳糖，D-蔗糖，菊粉，D-松三糖，D-棉籽糖， 淀粉，糖原，木糖醇，D-塔格糖，L-阿拉伯醇，葡糖酸鉀，2, 5-酮葡糖酸。
[0008] 菌株D414分類學特征描述如下：提取菌株D414純培養物基因組DNA，采用正向引 ^JPl:5'-egggatccagagtttgatcctggcteagaaegaaegct_3'i向弓|^Jp6:5'-egg gatcctaeggetaccttgttaegaettcacccc_3'PCR法擴增菌株D414 的 16SrDNA序 列。PCR產物純化后測序，結果通過比對GenBank/EMBL/DDBJdatabases和EzTaxon-e數 據庫收錄細菌16SrDNA序列。通過構建基于16SrDNA序列的系統進化樹（圖2所示）， 細胞壁脂肪酸分析，全細胞蛋白電泳（SDS-PAGE)(圖3所示），DNA-DNA雜交，生理生化特 征比較等多項分類法研宄，結果表明，菌株D414細胞壁脂肪酸構型主要為：C14:(l，C16:(l，C17:Q cyclo,和C18:1?7c.基因組DNAG+C含量為62.3±0.5mol%。菌株D414與已有效命名的 Burkholderia菌屬模式株BurkholderiatropicaDSM153591,Burkholderia.bannensis NBRCE25T，BurkholderiaunamaeDSM17197T 16SrDNA序列相似性分別為 98.5%，98.3% 和98. 3%。綜上多項分類學研宄結果可見，菌株D414與有效命名的Burkholderia菌屬模 式株間存在顯著差異，菌株D414為Burkholderia菌屬一個新種，根據國際微生物菌種命名 法命名為Burkholderiametalliresistens模式株為D414,現分別保藏于"德國微生物保藏 中心（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSMZ) "，保藏號 為DSM26823和中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC)保藏號CICC10561。
[0009] 3.本發明同時提供了一種含有以上所述菌株的耐重金屬植物促生菌制劑及其應 用，所述的促生菌制劑為液體制劑，制劑中含有以上所述菌株的有效活菌數量為10-15億 個/毫升，應用方法是將所述植物促生菌劑稀釋200倍浸泡植物種子1小時后播種，促進重 金屬脅迫下植物正常生長發育。
[0010] 本發明的優點和積極效果：
[0011] 本發明所述菌株D414具有多種重金屬（鉛、鎘、銅、鋅）耐受性，且能產生植物生 長激素IAA，固氮，溶解難溶性無機磷酸鹽，可以緩解重金屬毒害顯著提高接種植物生物量。 其具體功能如下：
[0012] 1.重金屬污染土壤植物根際促生菌新種的發現
[0013] 根際土壤中存在著數量和種類驚人的微生物種群（每克土壤中存在4,000~10， 〇〇〇種原核微生物，總數約2X109個），它們與植物根系以及土壤形成特殊土壤微環境，是 植物根際土壤中最重要的生物因素。其中只有約不到10%為人類所知。因此，1)分離篩選 根際有益微生物新種能夠豐富我們對這個數量和種類驚人的微觀世界的認識；2)通過研 宄這些微生物新種生理特征，能夠促進我國農業安全生產技術，有助于提升我國農田污染 修復技術水平。
[0014] 2.植物促生特性
[0015] 重金屬污染農田常體現出，土壤質量下降，作物養分利用率低等特征。本發明所述 菌株D414具有較強難溶性無機磷酸鹽增溶能力，能夠促進宿主作物對無機營養元素如磷、 鉀的吸收利用效率，同時通過產生植物生長素IAA與聯合固氮作用促進作物根系生長，增 加根系吸收面積，從而促進作物生長發育。
[0016] 3.緩解植物重金屬毒害
[0017] 重金屬元素對植物的毒害體現在植物體內乙烯含量升高，較高濃度乙烯能夠顯 著抑制植物細胞分裂，負調控植物生長，最終可導致植物生長受到明顯抑制。1-氨基環丙 烷-1-羧酸（ACC)作為乙烯合成前體物質對于調控植物體乙烯濃度具有重要意義。本發明 所述