用于活體外測定致肥胖風險的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測致肥胖風險的方法，尤指利用多個特定基因的單一核苷酸多 型性于活體外測定致肥胖的風險的方法
【背景技術】
[0002] 脂肪代謝與熱生成（thermogenesis)的調節影響到動物利用能量的效 率，而線粒體為動物體內涉及能量的位置，主要功能是產生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP)作為能量來源供給細胞利用。ATP的產生是通過內膜上的ATP合成酶 進行二磷酸腺苷（adenosinediphosphate,ADP)的磷酸化稱合反應而得。所謂稱合反應 (coupling)是指線粒體結合磷酸化反應與質子流動（protonflow)的一種化學滲透作用。 ATP生成可通過去f禹合蛋白（uncouplingprotein，UCP)進調節，使能量不以ATP形式儲存， 而是以熱能的形式釋放。編碼去耦合蛋白的基因，主要區分為去耦合蛋白Uuncoupling proteinl，UCPl)、去稱合蛋白 2(uncouplingprotein2，UCP2)及去稱合蛋白 3(uncoupling protein3，UCP3)三種，其在人體表達的位置不同。UCP1主要表達在褐色脂肪，UCP2在各個 組織都有表達，UCP3則同時表達于褐色脂肪以及骨胳肌，其功能除了參與去耦合作用外，也 有調節脂肪代謝與熱生成的功能。
[0003] 實驗中發現提高線粒體內膜外質子梯度濃度的消耗可以促進基礎代謝率（AmJP hysiol. 19960ct;271(4Ptl) :C1380-9)，因此UCP3可調節骨胳肌線粒體內膜質子流動產生 熱能，影響人體基礎代謝能力，并增加能量消耗，減少過多的能量轉換成脂肪儲存。UCP3的 基因變異研究中，位在外顯子3 (exon3)內的rsl800006 (Tyr99Tyr,T-C)變異被發現C對 偶基因與法國高加索人肥胖有關，且與功能性啟動子（promoter)區域內的rsl800849變異 (-55C-T)有很強的連鎖不平衡（linkagedisequiliburium，LD)，該變異可能影響UCP3 基因mRNA表達的穩定性（Diabetologia. 2000Feb; 43 (2) : 245-9)。但在歐洲其他的研究中， 發現rsl800006 與糖尿病及胰島素抗性有關（HormRes. 2008; 69(1) : 31-6.Epub2007Dec4; Diabetes. 2008Apr; 57 (4) : 1101-7.doi: 10. 2337/db07-1269.Epub2008Jan25)。因此，目前 尚未有利用UCP3基因變異來判斷測定致肥胖風險的技術，仍待有進一步改進的技術，以增 加利用UCP3基因變異的檢測準確性。
[0004] 多配體蛋白聚糖（syndecan,SDC)是一種硫酸肝素蛋白聚糖（heparansulfate proteoglycan,HSPG),主要由核心蛋白（coreprotein)及硫酸肝素聚糖鏈（heparin sulfatechain)兩個部分所組成。SDC基因家族主要存在于細胞膜上，由4個成員組成 (SDC1~SDC4)，其中多配體蛋白聚糖3(syndecan3,SDC3)主要表達于神經系統，包含控制 食欲的下視丘。在正常小鼠禁食實驗中，發現禁食狀態下大腦下視丘神經細胞SDC3基因表 有顯著上升，推測此時SDC3可能是Agouti相關肽（Agouti-relatedpeptide,AGRP)的共同 受體，并通過AGRP結合褪黑素受體（melanocortinreceptor)傳遞增加食欲的信號，促進 攝食行為。當給予喂食時，SDC3膜外結構（ectodomain)會脫離細胞膜使a黑色素刺激荷 爾蒙（a-MSH)可與褪黑素受體結合傳遞抑制食欲的信號。SDC3基因剔除小鼠（SDC3null mice)也發現其脂肪量低于正常小鼠，且攝食量下降，能量消耗上升，推論SDC3基因可以調 節體重及身體能量的平衡。然而，在針對歐洲人種的研究結果發現SDC3的變異與肥胖發生 無顯著相關，再者，各個SDC3的SNP位點與肥胖發生的關聯性有所不同。
[0005] 基于上述可見，單獨以UCP3或SDC3基因作為肥胖基因指標恐仍有爭議之處，特定 而言，單獨利用UCP3或SDC3基因檢測致肥胖風險恐仍有不準確的疑慮。
【發明內容】
[0006] 有鑒于現有技術檢測致肥胖風險的方法，仍有檢測結果不準確的問題，本發明的 目的在于提供一種具有提高準確率的檢測致肥胖風險的方法。
[0007] 為達上述目的，本發明提供一種用于活體外測定致肥胖風險的方法，其利用多基 因的基因型判定致肥胖的風險，而具有相比于單一基因的基因型，可增加預測的準確度，以 降低不同個體僅由相同的特定單一基因判定致肥胖風險的產生錯誤的可能性，并可供用于 作為提供對應保健對策的依據。
[0008] 在一方面，本發明提供一種用于活體外測定致肥胖風險的方法包括下列步驟：
[0009] 齊備一含核酸的樣品，
[0010] 偵測該樣品的去|禹合蛋白3(uncouplingprotein3，UCP3)與多配體蛋白聚糖 3(syndecan3,SDC3)的對偶基因的基因型，以及，
[0011] 鑒別該樣品的UCP3與SDC3對偶基因的基因型，取得一鑒別結果，該鑒別結果是 UCP3與SDC3對偶基因的同時變異，該樣品為源自于一具有增加的致肥胖風險的個體。
[0012] 另一方面，本發明提供一種測定致肥胖風險的基因多型性標記，其是由UCP3與 SDC3基因型所形成的組合。
[0013] 依據本發明，所述的變異是例如，但不限于：核苷酸重復、核苷酸插入、核苷酸缺 失、復本變異或單一核苷酸多型性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)，所述的變 異造成插入子（intron)的序列變異、無義突變（nonsensemutation)或閱讀框架位移 (readingframeshift)〇
[0014] 依據本發明，該含核酸的樣品來自于一為亞洲人種的族群的個體；特定的，該個體 是漢人（HanChinese)。
[0015] 依據本發明，所述的核酸是脫氧核糖核酸或核糖核酸，優選為基因組脫氧核糖核 酸（genomicDNA)。如所知者，當所述的核酸是核糖核酸時，齊備一含核酸的樣品的步驟包 括，提供一核糖核酸，并且形成互補脫氧核糖核酸。
[0016] 依據本發明，所述的偵測UCP3與SDC3的對偶基因的基因型的步驟包括利用此 領域中所知的任何以一般遺傳工程、生物化學等方法鑒別UCP3與SDC3的對偶基因的基 因型的技術，例如，但不限于：聚合酶鏈鎖反應配合定序分析（PCRandSequencing)、即 時聚合酶鏈鎖反應（RealtimePCR)、限制性片段長度多型性（restrictionfragment lengthpolymorphism,RFLP)、質譜儀分析（MassSpectrometry);或者，任何其他合適的 分析基因型的高通量篩選方法（high-throughputscreeningmethod),諸如配合連接子 聚合酶鏈鎖反應（Linker-PCR)的生物晶片（Biochip)或次世代定序（Nextgeneration sequencing,NGS)〇
[0017]依據本發明，所述的UCP3對偶基因的變異發生于外顯子區域及非編碼區 (Untranslatedregion,UTR)內，所述的鑒別該樣品的UCP3與SDC3對偶基因的基因型包 括：分析UCP3與SDC3對偶基因的變異，以取得該鑒別結果，其中UCP3對偶基因的變異發 生于選自于由下列者所構成的群組的位置：rsl800849 (5端非編碼區）、rsl800006 (外顯子 3)、rs2075577 (外顯子5)、rs647126 (3端非編碼區）及rsl5763 (3端非編碼區）；特別是 在具有如SEQIDNO. 1所示序列的區域，該SNPrsl800006A-G對偶基因變異位在UCP3 基因外顯子區域內，為一同義單苷酸多型性（synonymousSNP)，雖不改變編碼出的酪氨酸 (Tyrosine)，但一般所知通常會影響UCP3mRNA的穩定性及轉譯效率。
[0018] 依據本發明，所述的SDC3對偶基因的變異發生于外顯子區域內，其中SDC3的 SNP系選自于由下列者所構成的群組：rs2282440、rs2491132以及rs4949184。特別是具 有如SEQIDN0. 2所示序列的區域內，該SNPrs2282440C-T對偶基因變異位在SDC3基 因外顯子區域上，使該基因轉譯后第329號氨基酸由蘇氨酸（Threonine)變異成異亮氨酸 (Isoleucine)〇
[0019] 依據本發明，所述的鑒別該樣品的UCP3與SDC3對偶基因的基因型包括：分析 UCP3與SDC3對偶基因，以取得該鑒別結果，其中UCP3對偶基因的變異發生于選自于由下列 者所構成的群組的位置：rsl800849、rsl800006、rs2075577、rs647126 及rsl5763。
[0020] 依據本發明，SDC3對偶基因的變異發生于選自于由下列者所構成的群組的位置： rs2282440、rs2491132 以及rs4949184。
[0021] 依據本發明，所述的測定致肥胖風險的基因多型性標記，其是由UCP3的SNP rsl800849、rsl800006、rs2075577、rs647126 及rsl5763 ;與SDC3 的SNPrs2282440、 rs2491132和/或rs4949184所形成的組合。
[0022] 更佳的，偵測該樣品的UCP3與SDC3對偶基因的基因型的步驟包含：將該樣品與兩 不同專一性探針相結合，所述專一性探針是分別針對UCP3的SNPrsl800006,以及SDC3的 SNPrs2282440 ;以及，其中該鑒別結果是UCP3的rsl800006為C同時SDC3的rs2282440 為T，則該樣品為源自于具有增加致肥胖的風險的個體。
[0023] 所述的UCP3對偶基因的變異發生于具有如SEQIDNO. 1所示序列的區域，優選 的，該序列的第26堿基位置為C。
[0024] 所述的SDC3對偶基因的變異發生于具有如SEQIDN0. 2所示序列，優選的，該序 列的第26堿基位置為T。
[0025] 依據本發明，所述的肥胖以選自于下列所構成的群組的數值為指標：個體的身體 質量指數（bodymassindex,BMI)、腰圍、腰臀比、體脂肪比率，以及血液中三酸甘油酯含 量。
[0026] 依據本發明，所述的個體的身體質量指數，如本領域所公知的，是體重（公斤）/身 商 2 (公尺2)。
[0027] 依據本發明，所述的腰圍為任何此領域中所接受的方式進行量測所得到的數值， 優選的是指除去腰部覆蓋的衣物，輕松站立，雙手自然下垂，將皮尺繞過腰部，調整高度，讓 皮尺能通過左右兩側骨盆上緣(腸骨上緣）至肋骨下緣的中間，注意皮尺與地面保持平行， 并緊貼、不擠壓皮膚，維持正常呼吸，在吐氣結束時，量取的腰圍數值。
[0028] 依據本發明，所述的腰臀比（WaisttoHipRatio,WHR)是指腰圍和臀圍的比例， 數值等于腰圍除以臀圍，其中腰圍如前所述，而臀圍指在雙腿并攏時以水平最大寬度處的 量度值。一般而言，腰圍反映脂肪總量和脂肪分布的綜合指標，臀圍反映髖部骨胳和肌肉的 發育情況。腰臀比越大時，表示傾向于肥胖。
[0029] 依據本發明，前述的指標可以以一般正常人為基準，定義所述的肥胖，優選的，當 個體的身體質量指數（bodymassindex,BMI) 3 27公斤/公尺2、腰圍男性3 90公分，女 性蘭80公分、腰臀比男性蘭0.9,女性蘭0.85、體脂肪比率男性蘭30%，女性蘭35%，為所