檢測人類免疫缺陷病毒1型的pcr引物組、探針及其試劑盒和檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于病毒檢測領域，涉及一種檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR引物組、探 針及其試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002] 艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，是一種慢性致死性傳染病，由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV)引起，分為人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1)和人類免疫缺陷病毒2型（HIV-2)，HIV-1 是目前全球包括中國在內流行的主要毒株，HIV-2型目前只在西非流行。HIV感染后導致 人體免疫機能缺陷，從而發生機會性感染和腫瘤等一系列臨床綜合征，病死率幾乎達100%。 根據2011年數據，艾滋病已經波及全球200多個國家和地區，感染者總數已超過6000萬， 2000萬人死于艾滋病。由于該病潛伏期長、隱蔽性強、傳播途徑多樣化、病死率高，目前既無 能治愈的藥物也無有效的疫苗預防，給防治工作帶來了嚴重困難。
[0003] 我國目前處于HIV/AIDS廣泛流行期，政府采取了一系列堅決的措施，已經有效地 控制了非法采供血行為，用血安全性得到最大限度的保障，但是經靜脈注射吸毒和經性傳 播HIV的勢頭并未得到很好的控制，尤其是性傳播已成為主要傳播方式，而且在一些地區 已出現HIV感染者的第二代傳播（母嬰傳播、家庭內性傳播等），對全國HIV/AIDS的流行 蔓延無疑起到推波助瀾之作用。按照國家2014年最新頒布的治療標準，其中超過8成需要 立即開展和持續終生高效抗逆轉錄病毒治療（Highly active antiretroviral therapy， HAART)，在公衛、臨床、立法、治安等多方面均形成嚴重挑戰。擴大HIV檢測和抗病毒治療， 早診早治，降低新發數和病死率，是我國"十二五"以來艾滋病整體防控的戰略目標。
[0004] 目前國內外HIV檢測主要存在以下問題： (1) "窗口期"（指感染后到體內產生抗體、并達到檢出水平之間這段時間，期間具有感 染性但抗體檢測為陰性，受不同檢測方法和個體差異影響)及早期診斷。HIV感染后確定感 染的病毒標志物依次出現的順序為：病毒核酸（RNA與前病毒DNA)、病毒蛋白（如p 24抗 原)、病毒抗體。目前，國內外HIV常規檢測主要還是抗體血清學檢測（ELISA、WB)。此技術 已建立20余年，成熟可靠，然而一直受所謂"窗口期"問題的困擾，"窗口期" 一般在40天 以上。核酸檢測方面，由于病毒標志物出現更早，在窗口期前移上具有抗體檢測技術不可比 擬的優勢。但受靈敏度限制，目前外周血血清HIV RNA檢測（目前國內外已上市的病毒載量 檢測試劑盒檢出限在20~200拷貝/mL之間）仍有11天左右窗口期。
[0005] 雖然HIV-1是逆轉錄病毒，具有傳染力的病毒子是RNA，但是HIV進入人體后，會進 入到CD4+ T細胞，靠自身的逆轉錄酶逆轉錄為DNA，也就是通常所說的前病毒，然后整合到 細胞的基因組中，從而感染T細胞。目前國內已上市的HIV-1核酸檢測試劑盒是通過檢測 血里面的HIV RNA濃度來診斷是否艾滋病感染。在早期感染或正在進行抗艾滋病治療的患 者中，游離病毒子很少，而且病毒RNA在提取過程中容易降解，這類試劑盒難以檢測到。但 是細胞中還是有整合的HIV病毒基因，一旦人的免疫能力下降或者未及時用藥，這些整合 的病毒子就會開始復制，使病情發展。
[0006] (2)病毒儲存庫檢測。臨床對HIV抗病毒治療的結果評價分為"徹底治愈"和"功 能性治愈"。前者要求實現長期不進行任何抗病毒治療，體內仍檢測不到HIV核酸；后者效 果類似病毒精英控制者，體內仍可檢測到低水平的HIV-1 RNA和/或DNA，但長期免于HIV 相關疾患的損害。后續的研宄發現，接受HAART治療患者體內其實一直存在著另一種潛伏 形式的HIV-1，即所謂病毒儲存庫。chun等1997年首次發現了整合在靜止的記憶性⑶4+T 淋巴細胞中的病毒儲存庫，其中小部分含有整合的HIV DNA，可以在某種刺激下重新開始復 制-組裝病毒。這些潛伏的感染細胞十分穩定，因此病毒儲存庫已被廣泛認為是HAART無 法從患者體內清除HIV的主要原因和艾滋病治愈的最大障礙。
[0007] 近年來病毒儲存庫相關主要檢測技術包括：①QVOA (Quantitative viral outgrowth assay)，又名 IUPM (Infectious Units Per Million)分析，由 Siliciano 和Siliciano 2005年建立。該方法對人員和設備要求較高，價格昂貴，樣本需求量大 (120-180mL血液)，費時費力，且結果準確性影響因素眾多，檢出率偏低，也不適用于組織活 檢。②⑶4+T淋巴細胞計數，多采用⑶4/8/3流式儀檢測，但沒有證據表明能直接反映HIV 病毒儲存庫的變化，有無一定相關性尚待進一步求證。③RNA檢測。如上述，由于HAART能 夠非常有效地控制患者血漿HIV-1 RNA含量，甚至將其降低至臨床常規檢測的低限（20-50 拷貝/mL)以下，而且RNA檢測對設備、人員及標本提取要求較高，因此其無法應用于病毒儲 存庫檢測。
[0008] (3)新生兒HIV感染的診斷。HIV感染的母親其嬰兒由于母體抗體的存在，用抗體 檢測法通常為陽性。但實際上只有20%~60%的嬰兒可在母親的子宮里、在分娩和引產或 通過產后哺乳時從其母體感染HIV。新生兒血清陽性者并不能說明是HIV感染。因為母體 HIV抗體可持續大約15個月之久，在一般情況下，嬰兒并不表現出HIV感染的任何癥狀。病 毒細胞培養法對嬰兒并不是一種可靠實用的方法；HIV特異IgM抗體的檢測在母體抗體存 在下也是不可能的，在過量血清抗體存在下檢出血清中的HIV抗原也十分困難。對這些嬰 兒用可靠的核酸方法進行HIV感染的早期診斷是十分重要的。另外，嬰幼兒被HIV感染后 病情發展較快，早期診斷對及時采取治療措施，延緩阻止病情發展極為重要。
[0009] 綜上所述，傳統的HIV檢測方法，受限于"窗口期"、耗時、花費及標本要求高以及 檢測靈敏度低等特點，亟需開發一種高敏感的HIV DNA檢測方法。目前國內外鮮見有HIV DNA檢測試劑盒，有文章報道的HIV DNA PCR檢測方法靈敏度均在每百萬細胞檢測到10拷 貝HIV DNA或以上。
【發明內容】
[0010] 為了解決上述問題，本發明通過大量實驗研宄篩選出高靈敏和高特異性的引物序 列和檢測探針，及特定的PCR反應程序和條件，構建了高敏感HIV-1 DNA PCR檢測試劑盒及 檢測方法，最低檢測限可達每個反應可檢測2拷貝HIV-1 DNA/百萬細胞。
[0011] 本發明的目的在于提供檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR引物。
[0012] 本發明的另一目的在于提供一種檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR檢測試劑盒。
[0013] 本發明的再一目的在于提供一種檢測檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR檢測方 法。
[0014] 本發明所采取的技術方案是： 檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR引物組，該引物組為引物組1或引物組2或引物組 3,其中， 引物組 1 由 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6 組成； 引物組 2 由 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 組成； 引物組 3 由 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 組成。
[0015] 檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR檢測探針，其序列為：SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21 和 SEQ ID N0:22;或者為該些序列的核苷酸互補序列。
[0016] 進一步的，上述探針序列5'端標記的熒光基團為FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一種， 探針序列3'端標記的淬滅基團為TAMRA、MGB、BHQ中一種。
[0017] 一種檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR檢測試劑盒，該試劑盒含有至少一組上述 所述的引物組。
[0018] 進一步的，上述試劑盒還含有檢測探針；具體探針情況如下： 當試劑盒中含有引物組1時，該試劑盒就還含有探針SEQ ID N0:15或其核苷酸互補序 列； 當試劑盒中含有引物組2時，該試劑盒中就還含有探針SEQ ID NO: 16、SEQ ID N0:17、 SEQ ID NO: 18或者該些序列的核苷酸互補序列中的至少一條探針； 當試劑盒中含有引物組3時，該試劑盒中就還含有探針SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、 SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22或者該些序列的核苷酸互補序列中的至少一條探針。
[0019] 進一步的，上述試劑盒還含有細胞定量引物組和細胞定量探針，所述細胞定量引 物組由 SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25 和 SEQ ID N0:26 組成；所述探針為 含SEQ ID NO:27或者為其核苷酸互補序列； 細胞定量探針序列所標記的熒光基團可從FAM、HEX、VIC、CY5、TET選擇，但不同于上述 檢測目的基因探針的熒光基團。
[0020] 進一步的，上述試劑盒還含有：強陽性對照品、弱陽性對照品、陰性對照品、陽性定 量參考品和含有酶與UNG酶的酶系。
[0021] 進一步的，上述陽性定量參考品為8E5或Ach2細胞株基因組，用于同時對HIV DNA 及細胞數定量。
[0022] -種檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR檢測方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) DNA提取： 取待測全血樣本、陰性質控品、弱陽性質控品、強陽性質控品、陽性定量參考品各 200 yl，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取試劑盒，按說明書操作，分提取各組樣品的 DNA作為模板； 2) PCR反應體系： PCR 反應液 29. 2 y L ; 酶系 0.8yL; DNA模板 20 y L ; 3) PCR反應程序： 以A