一種提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于疫苗制備技術領域，具體涉及一種提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方 法。
【背景技術】
[0002] 口蹄疫（Foot-and - mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（FMDV)引起的偶蹄動 物烈性接觸性傳染病，主要危害牛、羊、豬等，發病率極高，傳播速度極快，尤其在豬群中能 引起大范圍流行，造成嚴重的經濟損失。世界動物衛生組織（OIE)將其列為通報疫病，我國 農業部也將其劃定為一類動物傳染病。目前已知的FMDV包括A、0、C、Asia 1、SAT 1、SAT2 和SAT 3 7個沒有交叉免疫保護的血清型，在長期的相互傳播感染中又形成60余個亞型。
[0003] 隨著現代分子生物學技術的發展，FMD疫苗的研制不斷深入和改進，已從傳統疫苗 向新型疫苗方向發展，即應用生物技術提供一種安全、有效的基因疫苗來控制FMD的發生。 弱毒疫苗中減弱的毒株對一種動物的減毒并不能保證對其他動物減毒，且由于新的亞型不 斷出現及毒株致弱結果和致弱時間都不能確定。1964年歐洲口蹄疫防治委員會決定歐洲國 家不用弱毒疫苗免疫，停止了弱毒疫苗的研究。目前世界許多國家和地區在FMD的防治中 都采用滅活疫苗，但滅活疫苗的缺點是熱穩定性差，需要低溫保存，免疫持續期短，抗病毒 譜有限，不能區分注射疫苗動物和自然感染動物，同時存在病毒滅活不徹底而散毒的可能 性。
[0004] 現有技術中，常采用基因工程來制備疫苗所需活性蛋白。但活性蛋白的提取與應 用是與其表達量和可溶性高度相關的。一般而言，決定蛋白能否用于科學試驗或者臨床研 究主要有三個因素：表達、可溶和純化。相對而言，蛋白表達和純化的技術難題比較容易克 月艮，而蛋白的可溶性表達則是一個技術性瓶頸。蛋白不可溶的原因與機理研究尚處于探索 階段，但一般認為兩個因素導致了蛋白的不可溶：一個是蛋白翻譯的速率，另一個是蛋白折 疊的速率。
[0005] 現有研究中，提高蛋白表達可溶性的一種途徑是通過表達菌株和改變表達的條件 來提高蛋白表達的可溶性，但是效果有時不太理想，而且由于包涵體的存在，因而這種途徑 的改進效果是不穩定的；另外一種較為重要和有效的方法是在活性蛋白末端增加可溶性標 簽，通過可溶性標簽和目的蛋白的融合，通過標簽自身的折疊從而來增加目的蛋白的可溶 性。但是不同的可溶性標簽對于不同的活性蛋白，其所能提高的可溶度效果是不同的，而且 由于可溶性標簽在后期常需進一步移除，因而針對不同的活性蛋白，選擇最適的可溶性標 簽常是重點，也是難點工作。
【發明內容】
[0006] 本發明目的在于提供一種可提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法，該方法主要是 通過同時增加多聚組氨酸（6 X His)標簽和MBP標簽的方法來提高口蹄疫蛋白的可溶性；同 時本發明以此方法為基礎，提供了一種口蹄疫重組蛋白CDG276,結果表明，采用該方法后， 其表達量和可溶性均有較大改進。
[0007] 本發明所采取的實際技術方案如下。
[0008] 一種提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法，在采用基因工程進行口蹄疫蛋白表達 時，通過基因工程手段，在口蹄疫蛋白的C端通過增加 HiS6-MBP標簽可增加口蹄疫蛋白的 可溶性，所述His6 (6XHis)表示6個組氨酸標簽，MBP (Maltose-binding protein)表示 麥芽糖酶結合蛋白。
[0009] 所述免疫用口蹄疫蛋白，為針對A型口蹄疫用免疫口蹄疫蛋白。
[0010] 所述提高口蹄疫蛋白可溶性的方法，進一步的可增加 TEV標簽，即在口蹄疫蛋白 末端所增加標簽為His6-MBP-TEV，以便于作為蛋白酶切割位點，所述TEV表示煙草蝕刻病 毒蛋白酶。
[0011] 利用所述提高口蹄疫蛋白可溶性的方法所制備的免疫用口蹄疫重組蛋白，該蛋白 編號為CDG276,其是以A型FMDV VPI上部分抗原表位構象氨基酸堿基序列為抗原位點，該 蛋白表示形式為：NdeI-Extag-Sitag3-NheI-YPYDVPDYA-ENLYFQ-BamHI-FMDVAl-XhoI，其中 NdeI、NheI、BamHI、XhoI表示相應的酶切位點序列，Extag_Sitag3為Extag_Sitag3標簽序 列，YPYDVPDYA、ENLYFQ、FMDVAl分別表示相應的蛋白序列，具體堿基序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0012] 所述免疫用口蹄疫重組蛋白的制備方法，包括如下步驟： (1) 構建如SEQ ID NO. 1所示免疫用口蹄疫重組蛋白⑶G276堿基序列， (2) 將免疫用口蹄疫重組蛋白CDG276堿基序列與質粒載體連接，所述質粒載體選擇質 粒pET21b，酶切位點選擇NdeI酶和XhoI酶兩個酶切切位點之間，構建重組質粒表達載體 pET21b-CDG276 ; (3) 構建攜帶有可提高可溶性標簽His6-MBP-TEV的重組質粒pMD19-T-His6-MBP-TEV， 可溶性標簽His6-MBP-TEV的堿基序列如SEQ ID NO. 2所示； (4) Nhe I和BamH I分別雙酶切步驟（2)中的pET21b-CDG276與步驟（3)中的 pMD 19-T-Hi S6-MBP-TEV，雙酶切后回收相應片段并連接，構建用于FMDVA1蛋白表達的 pET21b-His6-MBP-TEV-CDG276重組表達質粒，為便于描述，將此重組表達質粒命名為 pET-9,堿基序列如SEQ ID NO. 3所示； (5) 將pET-9轉化大腸桿菌BL21細胞，IPTG誘導表達，表達完成后超聲破碎、離心、純 化即可獲得FMDVAl蛋白。
[0013] 一般而言，基因工程疫苗由于只含有病毒衣殼蛋白，不含有核酸，因而具有很高的 安全性。對FMDV抗原結構研究表明，VPl片段是FMDV的主要抗原位點，能誘導機體產生保 護性的中和抗體，并能產生部分的保護作用。本發明以A型FMDV VPI上的部分抗原表位 構象氨基酸堿基序列為抗原位點，設計出了最佳的表位組合形式，特異性地用于FMDVAl蛋 白的表達純化。與現有的基因工程所制備的FMDV VPI蛋白相比，表達量有較為明顯提高， 同時由于加入了可溶性的標簽麥芽糖結合蛋白（MBP)，所表達的FMDVAl蛋白可溶度提升明 顯，因而具有較好的推廣應用價值。
【附圖說明】
[0014] 圖1為質粒pET21b-CDG276的Nhe I和BamH I雙酶切電泳結果，其中1是DNA分 子質量標準DL5000,2、3是雙酶切電泳結果； 圖2是質粒pMD19-T-His6-MBP-TEV的Nhe I和BamH I雙酶切結果，其中1是DNA分 子質量標準DL2000, 2是雙酶切電泳結果； 圖3為重組質粒pET21b-His6-MBP-TEV-CDG276 (pET-9)的菌液PCR鑒定結果，其中1 是DNA分子質量標準DL2000, 2~6是菌液PCR結果，其中4~6為正確條帶； 圖4為重組質粒pET21b-His6-MBP-TEV-CDG276 (pET-9)轉化菌株BL21誘導表達蛋白 后菌液PCR鑒定結果，其中1是DNA分子質量標準DL2000, 2~4是菌液PCR結果； 圖5為構建pET-9重組質粒表達載體流程示意圖； 圖 6 為pET21b-CDG276誘導后的 SDS-PAGE 結果，其中 5 為Prestained Protein Marker I，1~4為pET21b-⑶G276未誘導全菌、誘導全菌、破碎后上清和破碎后沉淀； 圖 7 為 pET-9 誘導后的 SDS-PAGE 結果，其中 1 為 Prestained Protein Marker I，2~5 為實驗組pET-9未誘導全菌、誘導全菌、破碎后上清和破碎后沉淀。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合實施例對本發明做進一步詳細介紹，介紹具體實施例前，對本發明中所 用到部分試劑簡要介紹如下。
[0016] 主要試劑： rTaq 酶（RR901A)、DNA Maker DL2000、DL5000 購自 TaKaRa 公司； Prestained Protein Marker I、Agarose (瓊脂糖）購自 GENVIEW 公司； 限制性內切酶 BamH I (FD0054)、Nhe I (FD0974)購自 Thermo Scientific; 質粒切膠回收純化試劑盒（SK8132)、質粒小量提取試劑盒（SK8192)、IPTG購自上海生 工生物工程有限公司； Tryptone (胰蛋白胨）、Yeast Extract (酵母提取物）、Agar power (瓊脂粉）均購自 0XI0D公司； BCA蛋白定量試劑盒（43B00150 )、四甲基乙二胺（TEMED )、2 X SDS-PAGE電泳上樣緩沖 液購自北京鼎國昌盛生物技術公司； T4 DNA 連接酶（M0202S)、10X 連接酶緩沖液購自 NEW ENGLAND BioLabs。
[0017] 常規試劑及配制方法： (1) 100mg/mL氨節青霉素（Ampicillin，簡寫Amp):稱取5g的Ampicillin粉末，加入 無菌水溶解，定容至50mL，用濾膜過濾除菌，然后分裝至高壓過的EP管中，-20°C保存； (2) 100mmol/L IPTG :稱取0. 24g IPTG粉末，加入無菌水溶解，定容至10 mL，用濾膜 過濾除菌，-20 °C儲存； (3) LB 液體培養基：稱取 Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，加入超純水充 分溶解，定容至1L，調節pH值至7,高壓蒸汽滅菌，4°C保存； (4) LB (Amp)液體培養基：將IL的LB液體培養基中加入ImL 100mg/mL的Ampicillin， 使其終濃度為100Kg/mL，4°C保存； (5) LB(Amp)固體培養基：稱取 TryptonelOg，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，加入超純 水充分溶解，定容至1L，加入15g Agar power，高壓滅菌，高壓結束