三文魚及其深加工產品種類鑒定的雙重熒光定量pcr法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種適用于三文魚及其深加工產品種類鑒定的雙重熒光定量PCR檢 測方法。
【背景技術】
[0002] 三文魚（salmon)是對鮭科魚類或鮭鱒魚類的一個泛稱，被譽為"魚中至尊"、"水中 珍品"。三文魚主要產于北冰洋與大西洋、太平洋的交界水域，屬于冷水域洄游魚類。瀕臨 北冰洋的挪威是世界上最大的三文魚養殖與捕撈國，其產量占到了世界總產量的一半。挪 威三文魚以其品質最好、口感最佳，被國際美食界被譽為"冰海之皇"。目前國內公認的經濟 種類大概分3個亞科、7個屬、約36種。作為一個商品名稱，只要肌肉堅實而富有彈性、且白 色紋理清晰、色澤呈鮮紅色或橘紅色的鮭科魚類都可稱為三文魚。因此，在不同國家的消費 市場三文魚所涵蓋種類各不相同，比如挪威的三文魚主要為大西洋鮭，芬蘭的三文魚主要 是養殖的大規格紅肉虹鱒，美國的三文魚主要是阿拉斯加鮭魚。
[0003]作為一種新型的海鮮產品，三文魚因肉質鮮美、口味獨特、營養豐富，正應時登上 中國食品消費市場的舞臺，逐漸出現在廣大老百姓的餐桌上。據海關統計數據顯示，我國三 文魚年進口量呈持續上升態勢，逐漸成為世界三文魚主要進口國家之一。但由于國內外不 同地區對三文魚所指品種不一，三文魚進貨渠道多樣，產地多樣，導致國內市場三文魚品種 混雜，價格也相差很大，從幾十元到幾百元不等。并有業內人士透露，目前國內市場上已經 有用蝦紅素染色的養殖淡水虹鱒魚冒充挪威三文魚的現象。由于三文魚主要以生食為主， 淡水養殖魚類容易寄生寄生蟲類，這無疑大大增加了消費者感染寄生蟲的風險。另外非正 規渠道而來的進口三文魚在運輸過程中如冷鏈不完整，容易滋生細菌，品質更無從保障。對 于普通消費者而言，除根據權威機構給出的建議查看商家的檢驗檢疫合格證外，只能靠觀 察色澤、手感等這些感官判斷標準三文魚的品質。至于所購買三文魚的品種是否與標簽上 所標注的一致，更是無從判斷。因此，迫切需要建立靈敏、可靠的檢測方法與體系對進口三 文魚進行種類鑒定。
[0004] 目前，已報道的三文魚種類鑒定的方法有傳統形態學法、蛋白質電泳法和DNA分 子遺傳標記方法。形態學方法依賴于專業人士的長期工作經驗，對親緣關系相近的相似種 的判斷并非有效。而且對于市面上常見的加工過的三文魚產品（生魚片、罐頭類），可供種 類鑒別的形態學特征幾乎不存在；蛋白質分析方法不適用于深加工產品，因為產品加工過 程中的熱處理使蛋白質的生化特性及其結構完整性都被破壞；而基于DNA技術的分子生物 學方法，就顯示出明顯優勢。1)DNA比蛋白質耐熱性強。盡管DNA在加工過程中也會被降 解，但是仍然能提取出小片段的DNA。2)作為生物體的遺傳物質，DNA分子能夠提供更多信 息。3)DNA分子穩定，不受組織類型、年齡及生理狀態等因素的影響。
[0005]DNA分子技術用于種類鑒定有多種常見方法，如限制性片段長度多態性（RFLP) 標記、單堿基多態性（SNP)標記、微衛星（microsatellite)標記、DNA條形碼技術（DNA barcode)、熒光定量PCR技術等。
[0006] RFLP首先需要對目標DNA片段進行PCR擴增，然后選擇合適的限制性內切酶切 割擴增片段，通過瓊脂糖凝膠電泳獲得不同物種的限制性酶切片段圖譜。該方法花費低， 操作簡單，但也存在諸多缺點：1)由于存在種內變異以及不同密碼子的簡并性特征，同一 物種不同個體可能存在不同的限制片段酶切圖譜；2)除生魚片外，三文魚深產品（如三文 魚罐頭）在加工過程中通常使用長時間（>15min)高溫（>115°C )處理，DNA分子常降解為 100-200bp的小片段，這可能嚴重影響酶切片段的多態性的判斷。
[0007] SNP和microsatellite標記常用于三文魚同種魚類的群體分析。DNA barcode 是通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析從而進行快速物種鑒定的技術，由Hebert 等（2003)首先提出。2003年，海洋生物普查研究首次將DNA Barcode技術用于標本編碼。 2004 年，生命條形碼聯盟（the Consortium for the Barcode of Life, CB0L)成立，支持 生物DNA條形碼研究的發展。至今，該組織下的魚類DNA條碼（Fish Barcode of Life campaign, FISH-B0L)已經獲得了 10267個種的DNA條形碼記錄，包含97%的魚類品種。該 方法在新物種的發掘和物種系統進化分析方面非常高效，但其缺點是混合樣品中通常有多 種成分被同時擴增，會造成測序結果的雜亂，因此不適用于混合樣品的鑒定。
[0008] 熒光定量PCR技術是近年來發展起來的新的核酸定量檢測方法，它在常規的PCR 基礎上加入熒光信號物質（探針或染料），利用熒光信號積累實時監測整個PCR過程，最后 通過擴增曲線的Ct值（熒光信號強度達到基礎信號（Base Line)時的循環數，表明PCR開 始進入指數擴增期）對未知模板進行定量分析。它集中了核酸雜交特異性強和PCR擴增靈 敏度高的優點，檢測范圍廣（多7個數量級）、檢測極限低（lc/r)，可同時對多個樣品進行 快速準確分析，被認為是目前最可靠的核酸定量檢測技術。在我國進出口食品的檢驗檢疫 方面，已廣泛應用于病原體檢測、有害生物風險分析以及轉基因產品的監管等多個方面。
[0009] 近年來新發展的雙重熒光定量PCR技術，即在一個反應體系中含兩對引物和不同 熒光基團標記的探針，通過實時熒光反應可同時檢測兩種目標基因，建立快捷準確的雙重 熒光定量PCR方法進行種類鑒定。
【發明內容】
[0010] 本發明要解決的技術問題是提供一種雙重熒光定量PCR技術，利用該技術靈 敏準確的特性，分別檢測鮭科的保守基因和4種三文魚（虹鱒（O.mykiss)、大西洋鮭 (S. salar)、紅大麻哈（紅鮭，0? nerka)、大馬哈魚（狗鮭，0? keta))的特異基因，建立一套 合適的雙重擴增和分析體系，從而對深加工三文魚產品種類進行雙重快速鑒定。
[0011] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種三文魚或其深加工產品種類鑒定的雙重 熒光定量PCR檢測方法中所用的特異性引物和探針，所述特異性引物和探針的序列由鮭科 以及大西洋鮭、虹鱒、狗鮭、紅鮭中的至少任意一種組成（如表1所示）：
[0012] 表 1
[0013]
[0014] 備注說明：
[0015] 上述鮭科FP中：m:a/c ;上述鮭科RP中：w:a/t，r:a/g，y:c/t。無論選用任意一 個，效果均一致。
[0016] 本發明還提供了利用雙重熒光定量PCR檢測三文魚或其深加工產品種類的方法， 包括以下步驟：
[0017] ①、鮭科以及4種常見三文魚的特異性鑒定引物與探針設計；
[0018] 所述4種常見三文魚為大西洋鮭、虹鱒、狗鮭、紅鮭；
[0019] ②、待測二文魚樣品中基因組DNA的提取；
[0020] ③、雙重熒光定量PCR擴增體系設置；
[0021] ④、根據實時熒光PCR檢測結果進行判斷（即，對市售三文魚樣品的種類鑒定，判 斷是否與標簽所述相符）。
[0022] 作為本發明的利用雙重熒光定量PCR檢測三文魚或其深加工產品種類的方法的 改進：所述步驟①是針對4種常見三文魚的16S rDNA、CR序列進行雙重熒光定量PCR檢測 的特異性鑒定引物與探針的設計。
[0023] 作為本發明的利用雙重熒光定量PCR檢測三文魚或其深加工產品種類的方法的 進一步改進：所述的探針5'熒光染料標記根據所采用的實時熒光PCR儀的配置和熒光基 團的發射光譜或者吸收光譜而定，鮭科5'熒光染料標記采用HEX，4種常見三文魚種類采用 FAM;探針的3'淬滅集團均選擇TAMRA熒光標記。
[0024] 作為本發明的利用雙重熒光定量PCR檢測三文魚或其深加工產品種類的方法的 進一步改進：
[0025] 所述步驟①中的特異性引物和探針的序列由鮭科以及大西洋鮭、虹鱒、狗鮭、紅鮭 中的至少任意一種組成（具體如上述表1所示）。
[0026] 作為本發明的利用雙重熒光定量PCR檢測三文魚或其深加工產品種類的方法的 進一步改進：
[0027] 所述步驟③雙重熒光定量PCR擴增體系設置；
[0028] 雙重熒光