生物傳感器微陣列構成和方法
【專利說明】生物傳感器微陣列構成和方法
[0001] 交叉參考
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時專利申請61/791，952的優先權，其 全文通過引用納入本文。
[0003]發明背景
[0004] 蛋白質微陣列領域的當前狀態促使以高密度形式從DNA微陣列中原位生產高質 量功能性蛋白質。目前的方法/技術包括，例如，核酸可編程蛋白質陣列（NAPPA)、蛋白質原 位陣列（PISA)、原位嘌呤霉素捕獲、從DNA陣列到蛋白質陣列（DAPA)、納米孔蛋白質陣列、 分析性微陣列（也稱為捕獲陣列）、功能性蛋白質陣列（也稱為目標蛋白質陣列）、反相蛋 白質微陣列（RPPA)等。在無細胞的方法中，將編碼cDNA、基因或質粒的微陣列打印在玻璃 基材上并與體外轉錄和翻譯（IVTT)混合物孵育，以在使用時表達新鮮蛋白質。也可通過打 印先前表達的純化蛋白質來生產蛋白質陣列，但這些蛋白質通常在表達、分離、純化和打印 的費力過程中丟失3D構象依賴性的功能。原位生成的蛋白質陣列通過首次促進對于蛋白 質和蛋白質功能的高通量研究而徹底改變了蛋白質組學領域。也發現其可廣泛地用于生物 標志物發現研究，發現親和結合劑，抗體譜和臨床驗證研究。不幸的是，目前的生產蛋白質 陣列的方法都無法符合對于生成基于蛋白質的生物傳感器的挑戰和質量要求。
【發明內容】
[0005] 本發明描述了生物傳感器微陣列，用于制備這類生物傳感器微陣列的方法，以及 其使用方法。
[0006] 在一個方面中，本發明描述了一種生物傳感器微陣列，其包含：（i)固體支持物基 材表面；（ii)與固體支持物基材表面連接的多個捕獲部分；（iii)由這些捕獲部分特異性 結合的多個檢測多肽或檢測肽；以及（iv)多個傳感器；這些多個傳感器中的每一個傳感器 都直接接觸或靠近多個捕獲部分中的一捕獲部分，且該生物傳感器微陣列基本不含體外翻 譯污染物。
[0007] 在一些實施方式中，這些檢測多肽包括激酶、蛋白酶、磷酸酶、氧化酶、還原酶、聚 合酶、水解酶、裂解酶、轉移酶、異構酶、連接酶、氧化還原酶、葡糖苷酶、糖苷水解酶、麥芽糖 糊精酶、脫氫酶、烯醇酶、分泌酶、合成酶、內切核酸酶、外切核酸酶、脂肪酶、加氧酶、纖維素 酶、環化酶、酯酶或其組合。
[0008] 在一些實施方式中，這些檢測多肽或檢測肽可逆地結合捕獲部分。在一些實施方 式中，當檢測多肽或檢測肽可逆地結合捕獲部分時，這些檢測多肽或檢測肽還包含可切割 接頭，該接頭的切割從捕獲部分中釋放檢測多肽或檢測肽。在一些實施方式中，該可切割接 頭是蛋白酶可切割的接頭（例如煙草黃邊病毒（TEV)蛋白酶切割位點；腸激酶切割位點，凝 血酶切割位點，或HRV3C蛋白酶切割位點），光可切割的接頭，或化學反應性可切割交聯物。 在一些實施方式中，當檢測多肽或檢測肽可逆地結合時，這些捕獲部分包含非共價親和部 分。在一些實施方式中，這些檢測多肽包含親和素的氨基酸序列，且這些非共價親和部分包 含脫硫生物素。
[0009] 在一些實施方式中，該生物傳感器微陣列中的捕獲部分包含抗體、生物素或鹵代 烷烴脫鹵酶標簽多肽的配體。在一些實施方式中，這些捕獲部分是抗體。
[0010] 在一些實施方式中，多個捕獲部分與多個珠或納米顆粒相連。
[0011] 在一些實施方式中，這些檢測多肽或檢測肽包含至少一種基材以進行酶促翻譯后 修飾（例如酰化、乙酰化、去乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、酰胺化、糖基化、氧化、糖化、 磷酸化、生物素化、泛素化、SUM0化、類泛素化、硫酸化、PEG化、瓜氨酸化、去磷酸化、去酰胺 化或消除化（eliminylation))。
[0012] 在一些實施方式中，多個檢測多肽或檢測肽包含具有相同氨基酸序列的至少兩種 多肽或肽，且該至少兩種多肽或肽之一包含不具有翻譯后修飾的相同氨基酸序列。
[0013] 在一些實施方式中，當捕獲部分是抗體時，這些檢測多肽或檢測肽包含表位標簽 且這些抗體特異性結合該表位標簽。在一些實施方式中，該表位標簽是谷胱甘肽-S轉移酶 (GST)、鹵代烷烴脫鹵酶、MYC標簽、FLAG標簽、血凝素（HA)標簽、6X-His標簽或熒光蛋白。
[0014] 在一些實施方式中，多個檢測多肽或檢測肽包含人多肽、病毒多肽、細菌多肽、真 菌多肽、非人動物多肽、植物多肽或其組合。在一些實施方式中，這些檢測多肽或檢測肽包 含人多肽。在一些實施方式中，這些檢測多肽或檢測肽包含至少100條各自獨立的人蛋白 序列（例如1000、5000、10000或20000條人蛋白序列）。在一些實施方式中，這些人檢測多 肽或肽是癌相關多肽或肽。在一些實施方式中，這些檢測多肽是病毒多肽、細菌多肽、真菌 多肽或其組合。
[0015] 在一些實施方式中，該生物傳感器微陣列的基材表面是金、銀、鍺、鋁或金屬膜夾 心結構。
[0016] 在一些實施方式中，多個傳感器包括場效應傳感器、壓電傳感器、聲波傳感器、諧 振器或懸臂傳感器。在一些實施方式中，這些場效應傳感器包括半導體納米線傳感器、金屬 納米線、碳納米管、納米線、基于石墨烯的裝置、納米帶傳感器、聚合物傳感器、電阻式傳感 器、電容式傳感器、電感式傳感器、巨磁電阻傳感器或其組合。
[0017] 在其他實施方式中，多個傳感器包括等離子體傳感器、量熱傳感器、電勢傳感器、 電流傳感器、電導傳感器、離子通道傳感器、離子敏感型傳感器或基于阻抗光譜的傳感器。
[0018] 在一些實施方式中，多個檢測多肽包含至少100種不同蛋白質的氨基酸序列。
[0019] 在一些實施方式中，多個傳感器中的一些傳感器直接接觸或靠近多個捕獲部分中 的各捕獲部分。在一些實施方式中，所述一些傳感器包括具有不同形狀、不同尺寸、不同厚 度、不同表面結構、不同表面化學或不同電特性的傳感器。在一些實施方式中，所述一些傳 感器中至少一種是參比傳感器。
[0020] 在一些實施方式中，多個傳感器包含納米結構、納米模式、微米結構、微米模式、中 間結構、中間模式、納米多孔或微米多孔的傳感器表面。
[0021] 在一個相關的方面中，本發明描述了一種生物傳感器微陣列試驗，其包括以下步 驟：（i)使上述生物傳感器微陣列與包含一種或多種分析物的樣品接觸，至少一種分析物 與生物傳感器微陣列的多個檢測多肽或檢測肽中至少一種結合的檢測多肽或檢測肽的特 異性結合或相互作用或反應生成可檢測信號；以及（ii)檢測和測定至少一種分析物與至 少一種檢測多肽或肽結合或相互作用或反應相關的信號水平。
[0022] 在該方法的一些實施方式中，在樣品中檢測至少十種不同分析物。在一些實施方 式中，至少一種待檢測分析物是蛋白質、酶、抗體、非肽藥物候選物、代謝物或核酸。在一些 實施方式中，這些分析物包含一種或多種待檢測抗體。在一些實施方式中，該樣品是來自人 對象的生物樣品。在一些實施方式中，當樣品是來自人對象的包含抗體的生物樣品時，該方 法還包括基于一種或多種抗體的存在或水平顯示是否存在身體病癥。
[0023] 在其他實施方式中，一種或多種分析物包含分子量為約100道爾頓至約900道爾 頓的藥物候選化合物。
[0024] 在該方法的其他實施方式中，一種或多種檢測多肽或檢測肽可逆地結合捕獲部 分。在一些實施方式中，當一種或多種檢測多肽或檢測肽可逆地結合捕獲部分時，該方法還 包括在使生物傳感器微陣列接觸樣品前釋放這些可逆結合的檢測多肽或肽。
[0025] 在另一個方面中，本發明描述了一種生物傳感器微陣列，其包含：（i)固體支持物 基材表面；（ii)與固體支持物基材表面連接的多個捕獲部分；（iii)由這些捕獲部分結合 的多個反應性多肽，各結合的反應性多肽都具有在目標配體存在的情況下相互作用或反應 以生成報告劑的活性；以及（iv)在目標配體或報告劑存在的情況下生成可檢測信號的多 個傳感器；這些多個傳感器中的每一個傳感器都直接接觸或靠近多個捕獲部分中的一捕獲 部分，且該生物傳感器微陣列基本不含體外翻譯污染物。
[0026] 在一些實施方式中，多個傳感器位于除連接有多個捕獲部分的固體支持物基材以 外的固體支持物基材表面上。
[0027] 在一些實施方式中，通過反應性多肽生成的報告劑是非熒光的。在其他實施方式 中，該配體或報告劑是反應性或氧化還原物質，其生成可檢測的電荷傳輸。在一些實施方式 中，該報告劑是報告多肽。在一些實施方式中，該報告多肽是被多個反應性多肽中一種或多 種反應性多肽翻譯后修飾的多肽。
[0028] 在其他實施方式中，該生物傳感器微陣列還包含特異性結合報告劑的多個捕獲部 分。
[0029] 在其他實施方式中，多個傳感器還包含對報告劑的存在敏感的包被層（coated layer)。在一些實施方式中，該涂層包含有機單層、生物分子單層、無機單層、多層膜、金屬 膜、介電膜或半導體膜。
[0030] 在其他實施方式中，該配體或報告劑與傳感器表面上沉積的另一種化學或生物單 層或多層或膜或有機或無機或介電或金屬或絕緣體或拓撲絕緣體或半導體膜反應，導致傳 感器中的響應。
[0031] 在一個相關的方面中，本發明描述了一種生物傳感器微陣列試驗，其包括：（i)將 上述生物傳感器微陣列與包含一種或多種目標配體的測試樣品接觸，使得一種或多種目標 配體與一種或多種反應性多肽的反應生成報告劑；以及（ii)檢測和測定報告劑的信號水 平。
[0032] 在另一個方面中，本發明提供了一種生成生物傳感器微陣列的方法，其包括：（i) 提供多個捕獲部分，其與固體支持物基材表面相連，其中多個傳感器直接接觸或靠近多個 捕獲部分；（ii)提供經排列的體外翻譯反應，其包含編碼多種檢測多肽的RNA、核糖體和從 RNA翻譯得到的多種檢測多肽；（iii)使經排列的體外翻譯反應與多個捕獲部分接觸，使得 多種檢測多肽特異性結合捕獲部分的陣列；以及（iv)清洗接觸的捕獲部分以除去非特異 性結合捕獲部分的體外翻譯污染物，從而獲得基本不含體外翻譯污染物的生物傳感器微陣 列。
[0033] 在上述方法的一些實施方式中，多個體外翻譯反應包括至少100 (例如500、1000、 5000或10000)個體外翻譯反應，其中各體外翻譯反應包含的多肽的氨基酸序列與其他翻 譯的檢測多肽不同。
[0034] 在一些實施方式中，經排列的體外翻譯反應排列于微米孔或納米孔中。
[0035] 在一些實施方式中，待生成的生物傳感器微陣列中的多個傳感器包括場效應晶體 管（FET)傳感器。
【附圖說明】
[0036] 圖1是多種類型的生物傳感器及其檢測形式的示意圖。
[0037] 圖2(上圖）是