一種經濟有效的細菌細胞破碎方法
【專利說明】一種經濟有效的細菌細胞破碎方法
[0001]摘要
本發明公開了一種經濟且快速有效的細菌細胞破碎方法，該方法根據反復冷凍與融化可以使細胞破裂的原理，采用液氮冷凍細胞組織與30°c恒溫水浴融化細胞組織技術，達到細菌細胞破碎的目的，若結合溶菌酶處理，效果更佳。這種方法簡單方便，適用于大多對溫度變化不敏感的蛋白質的分離純化前期細胞破碎處理。本發明的優點在于成本低，耗時短，效果好，操作易掌握，尤其針對小型實驗室及個人實驗室，設備少，經費有限的情況，可以推廣此種方法對細菌細胞進行破碎。使用此方法能夠在較短時間內獲得大量的細菌細胞破碎液，為蛋白質的進一步分離提純奠定良好的基礎。現有已知方法使用大型儀器如細胞破碎儀、超聲波破碎儀或-80°C低溫冰箱等對細菌細胞進行破碎，具有投資成本高，勞動成本高，技術難于掌握，耗時長，效果較差等弊端問題；而此方法所使用的細菌細胞破碎設備不涉及大型儀器，實驗室僅需具備液氮和液氮罐即可完成操作，較現有方法具有成本更低，操作更易掌握，耗時更短，效果更好的特點，有效地突破了現有已知方法破碎細胞帶來的弊端問題。這種方法的推廣是對倡導經濟節約型社會及經濟轉型發展號召的一種響應。
技術領域
[0002]本發明涉及一種細菌細胞破碎技術領域，具體涉及到反復凍融與溶菌酶結合原理破碎細菌細胞技術。
[0003]
【背景技術】
[0004]細胞破碎技術有很多，這些技術的普及在于人類向微觀研究領域深入的一種需要，人們需要獲得細胞內含物質，包括DNA和蛋白質等，一般為得到有活性的蛋白質，需要找到合適的破碎方法。不同的生物體，有不同的處理方法，由于細菌細胞壁的特殊結構，使得細菌細胞壁較其他生物細胞(如動物細胞)更難破碎，所以，關于如何破碎細菌細胞的問題成為研究熱點之一。雖然，目前已經出現多種細菌細胞破碎方法，包括利用細胞破碎儀及超聲波破碎儀這些機械破碎法，及利用-80°C與37°C反復凍融法等，但經過分析比較發現，這些方法的使用有以下幾種弊端:其一、這些方法都需要大型儀器設備細胞破碎儀、超聲波破碎儀或-80°C低溫冰箱等，價值不菲，尤其對小型實驗室或技術資金不足的個人實驗室來說，購買這些儀器是筆不小的開支；其二、使用細胞破碎儀這種機械破碎法涉及的具體問題是在儀器有限的情況下，每次可處理的材料體積有限，規模較小。而使用超聲波破碎儀這種機械破碎法涉及的具體問題是如何設定破碎參數，稍有不慎就容易造成材料的碳化現象，引起材料的質量下降和浪費等具體問題；其三、-80°C與37°C反復凍融這種方法涉及的具體問題是用-80°C冷凍溶液，耗時較長，勞動成本高，并且其效果不如使用液氮冷凍溶液破碎細菌細胞的效果。
【發明內容】
[0005]為優化細菌細胞的破碎方法，改善現有已知方法破碎細胞帶來的弊端問題，如投資成本高，勞動成本高，技術難于掌握，耗時長，效果較差等，發明此法。本發明提供一種投資成本低，勞動成本低，技術易掌握，耗時短，效果更佳的細菌細胞破碎方法，通過下列技術方案實現。
[0006]本發明提供的是這樣一種細菌細胞破碎方法，其特征在于包括下列步驟:
(1)收集細胞細菌細胞沉淀物:將待破碎的細菌細胞培養液均分為N份分裝于N個相等型號的EP管中(事先洗凈滅菌)，放于4°C低溫高速離心機中，對稱平衡，8000rpm-16000 rpm離心1-5 Hiin0去除上清液，收集細胞沉淀物；
(2)溶菌酶處理:每管中分別加入適量溶液A(3.0 mM咪唑，0.5 M NaCl, 20 mMTris-HCl，pH=7.9)，使細胞體充分重懸后，各加入溶菌酶(50 mg/mL)充分混合，至終濃度為 I mg/mL -2 mg/mL。冰浴 0.5 h_l h，或 4°C過夜；
(3)反復凍融:將上述EP管放在液氮中，迅速使其凝固。待其完全凝固后，取出EP管放在30°C水浴鍋中，使其充分溶解。注意溶解時要不斷搖晃EP管，避免EP管管壁溫度太高，而使蛋白質高溫變性；
(4)重復步驟(3)，使細胞反復凍融5-7次。待溶液呈粘稠狀時，停止凍融；
(5)根據所需提取的內含物的性質不同，對上述細胞破碎液進行不同處理，如需獲得蛋白提取液，下一步可對此溶液進行離心處理，去除沉淀。
[0007]
本發明具有下列優點和有益效果:本發明是從獲得細菌細胞沉淀物開始，對細胞進行溶菌酶處理半小時，接著對細胞進行反復凍融，使細菌細胞壁破碎完全，最后根據所需提取的內含物的性質不同，對上述細胞破碎液進行不同處理，如需獲得蛋白提取液，下一步可對此溶液進行離心處理，去除沉淀的步驟。本發明的優點在于成本低，耗時短，效果好，操作易掌握，尤其針對小型實驗室及個人實驗室，設備少，經費有限的情況，可以推廣此種方法對細菌細胞進行破碎。使用此方法能夠在較短時間內獲得大量的細菌細胞破碎液，為進一步的蛋白質分離提純奠定良好的基礎。現有已知方法使用大型儀器如細胞破碎儀、超聲波破碎儀或_80°C低溫冰箱等對細菌細胞進行破碎，具有投資成本高，勞動成本高，技術難于掌握，耗時長，效果較差等弊端問題；而此方法所使用的細菌細胞破碎設備不涉及大型儀器，實驗室僅需具備液氮和液氮罐即可完成操作，較現有方法具有成本更低，操作更易掌握，耗時更短，效果更好的特點，有效地突破了現有已知方法破碎細胞帶來的弊端問題。這種方法的推廣是對倡導經濟節約型社會及經濟轉型發展號召的一種響應。
[0008]
【具體實施方式】
[0009]下面結合實例對本發明作進一步的說明。
[0010]如需獲得200 mL細菌細胞蛋白質內含物，下一步對蛋白質進行分離純化，可先將細胞進行破碎處理，得到破碎完全的細菌細胞破碎液。
[0011]本發明【具體實施方式】:將待破碎的200 mL細菌細胞培養液均分為2份分裝于2個相等型號的EP管(事先洗凈滅菌)中，4°C低溫高速離心機中，對稱平衡，12000 rpm離心2Hiin0去除上清液，收集細胞沉淀物；每管中分別加入10 mL溶液A，使細胞體充分重懸后，各加入溶菌酶(50 mg/mL) 400 μ L，至終濃度為2 mg/mL。冰浴30 min，初步處理細胞壁。接著將此EP管放在液氮中，迅速使其凝固。待其完全凝固后，取出EP管放在30 0C水浴鍋中，使其充分溶解。融解時不斷搖晃EP管，從而避免EP管管壁溫度太高，而使蛋白質高溫變性。重復反復凍融步驟5_6次，待溶液呈粘稠狀時，停止反復凍融。最后，對溶液進行10000rpm離心15 min處理，去除沉淀物質，得到上清溶液。
【主權項】
1.一種經濟有效的細菌細胞破碎方法，其特征按下列步驟進行: (O收集細胞細菌細胞沉淀物:將待破碎的細菌細胞培養液均分為N份分裝于N個相等型號的EP管中(事先洗凈滅菌)，放于4°C低溫高速離心機中，對稱平衡，8000 rpm-16000rpm離心1-5 min，去除上清液，收集細胞沉淀物； (2)溶菌酶處理:每管中分別加入適量溶液A(3.0 mM咪唑，0.5 M NaCl, 20 mMTris-HCl，pH=7.9)，使細胞體充分重懸后，各加入溶菌酶(50 mg/mL)充分混合，至終濃度為 I mg/mL -2 11^/]\11，冰浴0.5 h_l h，或 4°C過夜； (3)反復凍融:將上述EP管放在液氮中，迅速使其凝固，待其完全凝固后，取出EP管放在30°C水浴鍋中，使其充分溶解，且注意溶解時要不斷搖晃EP管，避免EP管管壁溫度太高，而使蛋白質高溫變性； (4)重復步驟(3)，使細胞反復凍融5-7次；待溶液呈粘稠狀時，停止凍融； 根據所需提取的內含物的性質不同，對上述細胞破碎液進行不同處理，如需獲得蛋白提取液，下一步可對此溶液進行離心處理，去除沉淀。2.根據權利要求1(1)待破碎的細菌細胞溶液體積沒有限制，但是這些溶液要均分在相同EP管中，EP管的數量以便于離心配平為準。3.根據權利要求1(2)加入溶液A的體積要大于或等于待破碎的細菌細胞溶液總體積的1/20，同時溶液A要現配現用，破碎效果更好更徹底。4.根據權利要求1(3)使用液氮冷凍溶液，能夠迅速降低液體溫度，每次冷凍時間不超過2分鐘；接著在30°C水浴鍋中進行融解，邊融解邊搖晃EP管，可避免局部溫度過高，對蛋白造成的不利影響；用此方法破碎細胞可實現對大批材料的同時處理，避免細胞破碎儀這類儀器對處理材料體積的限制，以及超聲波這類儀器對設置條件的限制等。5.根據權利要求1(4)反復凍融的次數以液體呈現大量粘稠狀為根據，停止凍融；一般反復凍融5-7次時，即可完成操作。
【專利摘要】本發明公開了一種經濟且快速有效的細菌細胞破碎方法。此種方法采用液氮冷凍與30℃恒溫水浴融化技術，從而達到細菌細胞破碎的目的，適用于大多對溫度變化不敏感的蛋白質的分離純化前期細胞破碎處理。此法能夠在較短時間內獲得大量的細菌細胞破碎液，為蛋白質的進一步分離提純奠定良好的基礎。現有已知方法使用大型儀器如細胞破碎儀、超聲波破碎儀或-80℃低溫冰箱等對細菌細胞進行破碎，具有投資成本高，勞動成本高，技術難于掌握，耗時長，效果較差等弊端問題；而此法所使用的細菌細胞破碎設備不涉及大型儀器，實驗室僅需具備液氮和液氮罐即可完成操作，可有效地規避現有已知方法破碎細胞帶來的上述諸多弊端問題。
【IPC分類】C12N1/06
【公開號】CN105219646
【申請號】CN201510682709
【發明人】臧明麗, 余炎炎, 高進勇, 魯有強, 李歡, 其他發明人請求不公開姓名
【申請人】信陽師范學院華銳學院
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年10月21日