尸毒梭菌菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明是關于一經分離的尸毒梭菌（Clostridiumcadaveris)菌株ITRI04005及 其應用，尤其關于該尸毒梭菌菌株ITRI04005于進行發酵反應W生產有機化合物的應用， W及該尸毒梭菌菌株ITRI04005于基因改造的應用，包括：提供一可W表現或增強表現產 醇路徑酵素的基因的基因改造菌株、提供一減弱表現或不會表現參與乙酸合成的酵素的基 因的基因改造菌株、W及提供一可W表現或增強表現熱休克蛋白化eatshockprotein， HS巧的基因的基因改造菌株。
【背景技術】
[0002] W往關于梭菌屬（Clostridiumsp.)細菌的研究，大多是集中在致病菌株的探 討。然而，近年來隨著生質燃料化io化el)的發展，有些適用于生產生質燃料的梭菌也逐 漸受到重視，例如熱纖梭菌（Clostridiumthermocellum)具有強效的纖維素水解酶，其 可直接利用纖維素產生乙醇與氨氣。此可參見例如：化eier等人的文獻（ApplEnviron Microbiol. 1988Jan;54(1) :204-211)，該文獻全文并于此處W供參考。又例如，將達梭菌 (Clostridium,ljungd址lii)，其可W氣體（例如一氧化碳或二氧化碳等碳氧化物加氨氣） 作為原料而產生乙醇。
[0003] 盡管已有許多可用于生質燃料或化學品生產的菌株，但該等菌株一般是W發酵 培養基中的醋類作為碳源，并W發酵培養基中的蛋白腺（peptone)作為氮源，在碳源及氮 源缺一不可的情況下生產有機化合物，甚少菌株是可W利用不同類型的物質做為基質。此 夕F，微生物經由發酵反應W代謝基質所產生的代謝產物通常為成分復雜的混合物，必須通 過純化分離程序W取得所欲的標的代謝物。例如，梭菌屬（ClostridiumSP.)細菌通過丙 酬-下醇-乙醇（acetone-butanol-ethanol，AB巧發酵程序會產生下醇、乙醇、及丙酬，并 伴隨少部分的有機酸（例如乙酸、下酸）。另，微生物對于代謝產物的耐受性也是影響發酵 反應的產率的重要因素。因此，業界仍需要可利用不同類型的基質且同時提供良好的目標 產物產率的微生物，故致力于研究與開發可利用多元料源W生產化學品或生質燃料且具有 局廣物耐雙性的菌株。
[0004] 本發明即為針對上述需求所作的研究，本案發明人篩選得到一新穎的尸毒梭菌 (Clostridiumcadaveris)菌株ITRI04005,此菌株除可利用醋類及/或胺基酸作為基質W 生產有機化合物，其相較于其他已知的梭菌菌株更適合用于基因改造操作，W提供可利用 醋類及/或胺基酸作為基質生產有機酸或醇、具有高產物專一性、及/或具有高產物耐受 性的基因改造菌株，所獲得的基因改造菌株可應用于利用多元料源W生產化學品或生質燃 料，并提供良好的目標產物產率。
【發明內容】
[0005] 本發明的一目的，在于提供一種經分離的尸毒梭菌（Clostridiumcadaveris)菌 株口RI04005,其寄存于德國國家菌種保藏中屯、值SMZ)，寄存編號為DSM32078。該尸毒梭 菌菌株口RI04005具有如SEQIDNO: 1所示的16S核糖體核糖核酸（16SrRNA)片段，或具 有與SEQIDNO: 1具至少95%相似度的16S核糖體核糖核酸（16SrRNA)片段。
[0006] 本發明的另一目的，在于提供一種基因改造菌株，其是由尸毒梭菌菌株ITRI04005 經基因改造而得。較佳地，該基因改造菌株具有如SEQIDNO: 1所示的16S核糖體核糖核 酸（16SrRNA)片段，或具有與SEQIDN0:1具至少95%相似度的16S核糖體核糖核酸（16S rRNA)片段。較佳地，該基因改造菌株符合W下的至少一條：
[0007] (1)可W表現或增強表現產醇路徑酵素的基因；
[0008] 似減弱表現或不會表現參與乙酸合成的酵素的基因擬及
[0009] (3)可W表現或增強表現熱休克蛋白化eatshockprotein,服巧的基因。
[0010] 本發明的又一目的，在于提供一種生產有機酸的方法，其包含提供一基質，W及使 上述的尸毒梭菌菌株ITRI04005及/或上述的基因改造菌株于厭氧氛圍下利用該基質進行 發酵反應W產生有機酸。
[0011] 本發明的再一目的，在于提供一種生產醇的方法，其包含提供一基質，W及使上述 的基因改造菌株于厭氧氛圍下利用該基質進行發酵反應W產生醇。其中，該基因改造菌株 可W表現或增強表現產醇路徑酵素的基因。
[0012] 本發明的詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述于W下內容中，W供本發明 所屬領域技術人員據W明了本發明的特征。
【附圖說明】
[0013]圖1是顯示，于一厭氧氛圍下，將尸毒梭菌菌株ITRI04005W及尸毒梭菌模式菌株 (typestrain)BCRC14511培養于一葡萄糖濃度為5克/升的CGM培養基中，并于不同時間 點所測得的ODe。。數值的曲線圖；
[0014] 圖2A及圖2B是顯示，于一厭氧氛圍下，將尸毒梭菌菌株ITRI04005W及尸毒梭 菌模式菌株BCRC14511培養于一培養基，進行發酵反應后，所測得的下酸碳轉化率的長條 圖，其中，圖2A的培養基是一葡萄糖濃度為5克/升的CGM培養基，圖2B的培養基是一葡 萄糖濃度為3克/升且乳酸鹽濃度為2克/升的CGM培養基；
[0015] 圖3所示為帶有酒精去氨酶（alcoholdehy化ogenase，a化）基因的pGE536重組 質體；
[0016] 圖4所示為「pta-ack」基因片段經「catP」基因片段取代的PGE403轉殖質體；
[0017] 圖5A及圖5B所示分別為帶有hspl8基因的PGE406重組質體W及帶有「groE化」 基因的PGE407重組質體；
[0018] 圖6是顯示，于一厭氧氛圍下，將尸毒梭菌菌株ITRI04005、ITRI05023、W及 ITRI05025分別培養于一下酸鋼濃度為10克/升的CGM培養基中、或一不添加下酸鋼的CGM 培養基中，進行發酵反應后，所測得的相對下酸生成率的長條圖；
[0019] 圖7A及圖7B是顯示，于一厭氧氛圍下，將尸毒梭菌菌株口RI04005W及 ITRI05023培養于不同下酸鋼濃度的CGM培養基中，并于不同時間點所測得的ODe。。數值的 曲線圖，其中，圖7A的下酸鋼濃度為10克/升，圖7B的下酸鋼濃度為15克/升。
【具體實施方式】
[0020] W下將描述根據本發明的部分具體實施態樣；只是，在不背離本發明精神下，本 發明尚可W多種不同形式的態樣來實踐，不應將本發明保護范圍解釋為限于說明書所陳述 的。此外，除非文中有另外說明，于本說明書中（尤其是在權利要求書中）所使用的「一」、 「該」及類似用語應理解為包含單數及復數形式。另，本文所使用的「約」、「大約」或「近乎」 等詞，實質上代表與所述的數值相差在20%W內，較佳在10%W內，且更佳在5 %W內。
[0021] 此外，于本發明中，所謂的「微生物」是指肉眼無法看見的生物體（例如：細菌、 真菌），其可包括于自然界中自然存在的野生型（wildtype),W及因任何因素（天然或人 為）所產生的突變型（mutant)。所謂「發酵反應」是指微生物代謝一或多種物質W產生 有機化合物的過程。所謂「培養基」是指可提供微生物菌株生長、繁殖所需的養分與條件 (如酸堿值、濕度等）的必要成分物質，通常是視所欲培養的微生物菌株而調整組成，例如 可添加氯化氨、氨氧化鋼、氨氧化錠（畑4〇巧、硫酸錠（(NH4)2S04)、氯化錠（NH4CI)、乙酸錠、 酸氨二鐘（K2HPO4)、憐酸二氨鐘（KH2PO4)憐酸二氨鋼（NaHzPOs)、憐酸氨二鋼（NazHPOs)、巧 樣酸（citricacid)、含水硫酸儀（M拆〇4· 7&0)、含水硫酸鐵（FeS〇4· 7&0)、含水硫酸儘 (MnS〇4· 7&0)，W調整原料至一所欲的抑值（例如：p冊.5、P冊），或調整其他物理、化學或 生理性質。所謂「基質（substrate)」，是指能夠在微生物發酵反應中作為原料，進入發酵反 應的代謝路徑而被轉化為有機化合物的，本發明是使用含有例如醋類、胺基酸、或其組合的 基質。
[0022] 另，除非另外單獨限定，否則于本說明書中所述的化學名稱即指該化學名 稱的所有異構型式，舉例來說，但不限于，鏡像異構物（enantiomer)、非鏡像異構物 (diastereomer)及構形異構物（conformationalisomer)。舉例來說，「乳酸」、「葡萄糖」、 「木糖」、「半乳糖」等詞即同時包括D型值化rm)及L型化化rm)異構物。當該醋類可同 時存在開環及環狀型式時，其椅型（chair化rm)的構形異構物及α、β異構物均包括在 內。
[0023] 于本說明書中，所謂「碳轉化率」是指在發酵反應中，所生成的有機化合物的總碳 數與所消耗碳源的總碳數的比值，W如下式1進行計算。
[0024]式 1 :
[00巧]本案發明人自±壤樣本中篩選出一種新穎的梭菌，經16S核糖體核糖核酸（16S rRNA)序列分析，依親緣關系鑒定為Clostridiumcadave;ris(中文名稱為尸毒梭菌），且經 命名為ClostridiumcadaverisITRI04005(W下稱為尸毒梭菌菌株ITRI04005)，其寄存于 德國國家菌種保藏中屯、值SMZ)，寄存編號為DSM32078。尸毒梭菌菌株口RI04005具有如 SEQIDN0:1所示的16S核糖體核糖核酸（16SrRNA)片段，或具有與SEQIDN0:1具至少 95%相似度的16S核糖體核糖核酸（16SrRNA)片段。
[0026] 經發現，本發明尸毒梭菌菌株ITRI04005相較于其他已知的梭菌菌株更適合用于 基因改造操作。因此，本發明亦關于一種基因改造菌株，其是由尸毒梭菌菌株ITRI04005經 基因改造而得。
[0027] 于本發明中，所謂「基因改造」是指利用現代分子生物技術，W人為的方法修飾或 改變一物種（例如：動物、植物、微生物、病毒）的遺傳物質。可用于基因改造的手段包括， 但不限于，基因剔除（knock-out