豬細小病毒5a、使用方法及疫苗的制作方法
【專利說明】
[0001] 序列表
[0002] 本申請案含有根據37C.F.R. 1.821-1.825之序列表。本申請案之隨附序列 表W全文引用的方式并入本文中。2013年3月21日建立之該ASCII復本系命名為 10-0150-PCT-SEQ.txt且大小為 34, 542 字節。
技術領域
[0003] 本發明屬于動物健康領域且設及新豬細小病毒株（包括用于接種之減毒病毒 株）、制造方法及使用自該新穎細小病毒株獲得之疫苗之治療方法。
【背景技術】
[0004] 細小病毒感染多種動物物種，且其中一些可引起嚴重臨床疾病，但大部分該等 病毒僅引起輕度或亞臨床感染。其屬于細小病毒科（Parvoviridae)且形成兩個亞科： 濃核病毒亞科值ensovirinae)，其成員感染昆蟲；及細小病毒亞科（Parvovirinae)，其 成員感染脊椎動物。后一亞科當前包括五個屬：依賴病毒屬值巧endovirus)、紅病毒屬 巧ryt虹ovirus)、阿留申水貂病毒屬（Amdovirus)、博卡病毒屬度ocavirus)及細小病毒 (1) (Parvovirus(1))。 陽0化]細小病毒病毒粒子為非包膜型且含有約5-6千堿基化ilobases;化）之單股、線性DNA基因組。基因組由兩個主要開放閱讀框架（OR巧組成，該兩個主要開放閱讀框架編碼非 結構及衣殼蛋白。最近描述之博卡病毒在兩個主要0RF之間攜帶第Ξ個ORF(l)。
[0006] 細小病毒屬中之經典豬細小病毒（PPV1)株在全世界廣泛分布且可引起豬之生殖 性障礙，尤其在接種方案未正確進行或疫苗功效由于免疫抑制因子而降低之畜群中。在最 近十年期間，已在豬中檢測到多種新型細小病毒。該等細小病毒包括豬細小病毒2(PPV2) (2) 及相關病毒（3)。在香港鑒定一組新型豬及牛細小病毒，亦即胡可病毒化okoviruses) (P化V，B化V) (4)，且發現該等病毒在遺傳學上與人類PARV4及PARV5類似。盡管其最初W 香港命名為胡可病毒，但提出將KloV新型分類為PPV3巧）。PPV4展示與牛細小病毒2之最 高相似性，但編碼能力及基因組組構與博卡病毒類似，因為PPV4與博卡病毒類似地編碼位 于0RF1與0RF2之間的額外0RF3。然而，PPV4編碼之推定0RF3蛋白與博卡病毒編碼之蛋 白質顯著不同巧）。
[0007] 仍需要監測豬中新型病毒之出現及研發關于新型病毒之疫苗、治療及檢測方法。
【發明內容】
[0008] 本發明提供新穎核巧酸序列、蛋白質序列、免疫原性組合物、疫苗W及關于制造及 使用新型細小病毒株之方法，該等新穎細小病毒株尤其感染馴養豬。該等病毒株設及在來 自臨床患病之馴養豬之組織樣品中鑒定的新穎豬細小病毒；基于與已知豬細小病毒物種及 病毒株之序列同源性，該新穎病毒命名為豬細小病毒5A或PPV5A。
[0009] 本發明之組合物及方法使得檢測由該新型病毒所致之感染、監測野生及馴養動物 w及畜群中病毒序列之遺傳性變化，w及制造及使用新穎疫苗來保護動物免于病毒感染。
[0010] 本發明之免疫原性組合物及疫苗包含由SEQIDNO: 1之核酸序列編碼之多膚序 列，或其免疫原性片段，可選地包括用于誘導更強免疫原性反應的佐劑。
[0011] 本發明之例示性組合物包含沈QIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4之多膚序列 或其對PPV5A特異性抗體具有免疫反應性之片段中之任一者。本發明之較佳多膚包括SEQ IDN0:2或SEQIDN0:4之序列，尤其SEQIDN0:4。較佳地，該等多膚或其片段對PPV5A 特異性抗體具有免疫反應性。
[0012] 在另一方面中，本發明提供編碼一或多種多膚、抗體構建體或抗體綴合物之核酸 序列。編碼多膚之基因序列包含與SEQIDN0:1之序列至少95%、90%、85%或甚至80% 同源及/或相同的核酸序列，詳言之，SEQIDNO: 1(衣殼蛋白）之核巧酸序列2845-5547， 或SEQIDNO: 1中編碼對PPV5A特異性抗體具有免疫反應性之多膚的片段。本發明之例示 性核酸序列包括沈QIDNO: 1之核巧酸1975-2844及沈QIDNO: 1之核巧酸2845-5547之 序列，及其編碼對PPV5A特異性抗體具有免疫反應性之多膚的片段之序列中之任一者。較 佳地，核酸序列或基因為編碼對PPV5A特異性抗體具有免疫反應性之多膚或膚的核酸序列 或基因。
[0013] 此外，如本文中所用之本發明之多膚包括（但不限于）包含W下之多膚：
[0014] U包含沈QIDNO:2或沈QIDNO:4之氨基酸序列的多膚； 陽015] ii)與i)之多膚至少80%同源及/或相同之多膚；
[0016] iii)i)及/或ii)之多膚之片段；
[0017] iv)iii)或iv)之片段，其包含至少5個、較佳8個、更佳10個、甚至更佳15個包 括于SEQIDNO:2或SEQIDNO:4之序列中之連續氨基酸；
[0018] V)由多核巧酸編碼之多膚，該多核巧酸包含SEQIDNO: 1之核巧酸1975-2844或 沈QIDNO: 1之核巧酸2845-5547的序列；
[0019] Vi)由與Vi)之多核巧酸至少80%同源或相同之多核巧酸編碼之多膚；
[0020] vii)由多核巧酸編碼之蛋白質片段，該多核巧酸包含至少15個、較佳24個、更佳 30個、甚至更佳45個包括于沈QIDNO: 1之核巧酸1975-2844或沈QIDNO: 1之核巧酸 2845-5547之序列中之連續核巧酸。 陽021] 本發明之免疫原性組合物包含至少一或多種如本文中定義之PPV5A多膚，可進一 步包含生理學上可接受之媒介物，諸如醫藥學上或獸醫學可接受之載劑、佐劑或其組合。
[0022] 由此提供之任何PPV5A多膚或包含由此提供之該等PPV5A多膚中一或多者之任何 免疫原性組合物均可用作藥物，較佳用作疫苗或免疫原性組合物，最佳用于對象針對PPV5A 感染之預防或治療。
[0023] 尤其較佳PPV5A多膚包括具有免疫原性表位之多膚，該等免疫原性表位誘導對 PPV5A具有特異性之免疫學反應。較佳PPVA多膚包括具有在相關PPV1中被預測為表面抗 原之氨基酸序列的多膚（Simpson等人，JMB315, 2002)且包括（但不限于）SEQIDN0:4 之殘基 141-156、272-278 及 329-339。
[0024] 本領域技術人員將理解，本文中使用之組合物可合并有已知可注射、生理學上可 接受之無菌溶液。對于制備供非經腸注射或輸注之即用型溶液，可輕易地使用等張水溶液， 例如生理食鹽水或血漿蛋白溶液。此外，本發明之免疫原性及疫苗組合物可包括獸醫學可 接受之載劑、稀釋劑、等張劑、穩定劑或佐劑。
[00巧]本發明之方法包括（但不限于）在對象中引起針對PPV5A感染之免疫反應的方 法，其包含向對象施用包含一或多種如本文中定義之PPV5A多膚之免疫原性組合物的步 驟。較佳地，針對PPV5A之大于一種血清型或病毒株引起免疫反應。本發明之組合物可用 于治療或者預防PPV5A感染。較佳地，該免疫反應降低與一或多種PPV5A血清型之感染相 關或由一或多種PPV5A血清型之感染引起之一或多種臨床病征之發病率或嚴重性。
[00%] 本文中，需要接受本發明之組合物之施用的合適對象包括需要預防或治療與病 毒、微生物、寄生物、原蟲、細菌或真菌有關之感染、疾病或病狀的動物。藉由使用本發明之 組合物或方法來刺激免疫反應之動物包括家畜，諸如豬、牛、家禽（例如雞、鴨、碟或火雞）、 山羊及綿羊；及馴養動物，諸如小鼠、兔、犬、貓及馬。較佳動物包括豬、鼠科動物、馬科動物、 兔類動物及牛科動物。最佳在豬中刺激免疫反應。
[0027]本發明亦提供降低與PPV5A感染相關或由PPV5A感染引起之一或多種臨床病征之 發病率或嚴重性的方法，其包含施用本發明之免疫原性組合物之步驟，該免疫原性組合物 包含一或多種由此提供之PPV5A膚且較佳包含載體分子，使得與未接受由此提供之免疫原 性組合物的對象相比，PPV5A感染之臨床病征之發病率或嚴重性降低至少10%，較佳至少 20%，更佳至少30%，更佳至少50%，更佳至少70%，最佳至少100%。該等臨床病征包括 由單獨PPV5A感染引起之病毒血癥及免疫抑制。該等臨床病征可包括神經病學病征（抑郁 癥、共濟失調、嗜睡）、腹瀉、呼吸困難、體況損失、關節腫脹（引起販行及仰邸）、平均每日體 重增加降低、死亡及由與另一生物體（例如豬鼻支原體（Mycoplasmahyorhinis))之合并 感染引起之多發性漿膜炎。
[0028]根據另一方面，本發明亦設及預防PPV5A感染之方法，其中該PPV5A感染可由與 沈QIDNO1、2、3及/或4之核巧酸序列具有100%序列相同性、與沈QIDNO1、2、3及/ 或4之核巧酸序列具有至少95%序列相同性、與SEQIDNO1、2、3及/或4之核巧酸序列 具有至少90%序列相同性或與SEQIDNO1、2、3及/或4之核巧酸序列具有至少85%序 列相同性的PPV5A引起，該方法包含施用本發明之免疫原性組合物之步驟，該免疫原性組 合物包含一或多種由此提供之PPV5A膚。
[0029]本發明亦提供制備由此提供之任何免疫原性組合物之方法，該方法包含將一或多 種由此提供之PPV5A膚與載體分子混合，較佳使得該一或多種PPV5A膚及載體分子彼此共 價偶合或綴合。該等綴合物可為多價或單價的。多價組合物或疫苗包括多種PPV5A膚與載 體分子之免疫結合。在另一方面中，本發明提供制造一或多種PPV5A膚之方法，該方法包含 用編碼由此提供之任何PPV5A膚的核酸分子轉化宿主細胞（較佳為原核細胞，諸如大腸桿 菌巧.coli))。或者，宿主細胞可為真核細胞，諸如動物細胞、昆蟲細胞、原生生物細胞、植物 細胞或真菌細胞。較佳地，真核細胞為哺乳動物細胞，諸如CH0、BHK或COS;或真菌細胞，諸 如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae);或昆蟲細胞，諸如Sf9。本發明核酸之桿狀病毒 度aculovirus)表達亦為較佳。
[0030] 本發明之另一方面提供制造一或多種PPV5A膚之方法，該一或多種PPV5A膚誘 導針對至少一種PPV5A遺傳變體且更佳兩種或兩種W上PPV5A遺傳變體之免疫反應。此 方法包含培養經轉化之表達載體，該經轉化之表達載體編碼及表達一或多種本文中掲示之 PPV5A膚。經表達之蛋白質由表達生物體保留或分泌至培養基中。表達系在足W產生能夠 誘導針對PPV5A之免疫反應的PPV5A膚之條件下進行。PPV5A血清型（PPV5A膚誘導針對其 之免疫反應）包括（但不限于）具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、 91%或90%相同性之序列。
[0031] 制造本發明之組合物之方法可進一步包含將一或多種PPV5A膚與載體分子之綴 合物與生理學上可接受之媒介物（諸如醫藥學上或獸醫學可接受之載劑、佐劑或其組合） 混合。本領域技術人員將認識到媒介物、佐劑或組合之選擇將尤其由遞送途徑、個人偏好及 動物物種決定。
[0032] 在另一方面中，本發明提供診斷對象中之PPV5A感染之方法。該方法包含提供一 或多種PPV5A膚；使該一或多種PPV5A膚與自對象獲得之樣品接觸；及若在樣品中檢測到 能夠結合一或多種PPV5A膚之抗體，則鑒定對象患有PPV5A感染。
[0033] 在另一方面中，本發明提供確定對象先前已暴露于PPV5A感染且能夠表達針對 PPV5A之免疫反應的方法。該方法包含提供一或多種PPV5A膚；使該一或多種PPV5A膚與 自對象獲得之樣品接觸；及若在樣品中檢測到能夠結合一或多種PPV5A膚之抗體，則鑒定 對象患有PPV5A感染。
[0034] 本發明亦提供包含免疫原性組合物之試劑盒，該免疫原性組合物包含一或多種 PPV5A膚，較佳連同載體分子一起；用于封裝免疫原性組合物之容器；一組印刷說明書；及 能夠將免疫原性組合物施用動物之施配器。可選地，一或多種PPV5A膚及載體分子可W綴 合物形式或W各別化合物形式被封裝。當分開供應時，亦供應使一或多種PPV5A膚與載體 分子綴合之構件W及適當印刷說明書。
[0035] 本發明亦提供用于對動物進行接種之試劑盒，其包含一組印刷說明書；能夠將由 此提供之包含一或多種PPV5A膚之免疫原性組合物施用至動物之施配器；且其中至少一 種PPV5A膚有效地使動物對至少一種與PPV5A感染相關之疾病免疫。較佳地，該一或多種 PPV5A膚系選自由此提供之PPV5A膚。本發明之試劑盒可進一步包含獸醫學可接受之載劑、 佐劑或其組合。
[0036] 本發明之試劑盒中之施配器能夠將其內含物W液滴形式施配；且當經鼻內、經口、 皮內或肌肉內施用動物時，試劑盒中所包括之包含由此提供之PPV5A膚的免疫原性組合物 能夠降低PPV5A感染之至少一種臨床病征之嚴重性。較佳地，與未經治療之受感染動物相 tL臨床病征之嚴重性較佳降低至少10%，較佳至少20%，更佳至少30%，更佳至少50%， 更佳至少70 %，最佳至少100 %。
[0037] 亦掲示用于治療或預防由PPV5A引起之感染的方法。該方法包含向對象施用有效 量之本發明之免疫原性組合物，其中該治療或預防系選自由W下組成之群：減少PPV5A感 染之病征、降低PPV5A感染之臨床病征之嚴重性或發病率、降低由PPV5A感染引起之對象死 亡率及其組合。
[0038] 本發明之組合物進一步包含獸醫學可接受之載劑、佐劑或其組合。該等組合物可 用作疫苗且包含一或多種額外減毒疫苗、滅活疫苗或其組合。該等疫苗引起針對至少一種 與選自由W下組成之群之病毒相關的疾病之保護性免疫學反應：豬細小病毒1、2、3、4、5A、 5B、其它豬細小病毒種、其它豬病原性病毒及細菌及其組合。可與針對PPV5A之疫苗組合 共施用之其它類型之疫苗包括（但不限于）2型豬環狀病毒（例如