豇豆疫霉菌lamp檢測引物及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明豇豆疫霉菌LAMP檢測引物及其檢測方法，專用于豇豆疫霉菌高靈敏度快速LAMP檢測，同時可用于田間豇豆疫病的早期診斷和病菌的監測和鑒定，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術的領域。
【背景技術】
[0002]由5工豆疫霉菌Kinase)侵染所致的5工豆疫病是5工豆成株期主要病害，適宜發病溫度為25-28 °C，并且隨著雨水增多、濕度增大，病害亦趨嚴重，所以春季連續陰雨和梅雨期間是疫病高發期。其次，若通風不好、排水不良、施用不腐熟基肥或連作地，發病亦較重。其病原5工豆疫霉菌{Phytophthora vignae)是疫霉屬卵菌，隸屬于藻菌界，卵菌門，卵菌綱，霜霉目，腐霉科。目前為止，對該病害的檢測診斷主要是癥狀診斷和病原分離鑒定。癥狀識別方法如下:(1)莖部發病癥狀:莖部發病多發生在節部，初呈水漬狀，無明顯邊緣，病斑擴展繞莖一周后，表皮變褐色，病莖以上葉片迅速萎蔫死亡；(2)葉片發病癥狀:葉片發病初生暗綠色水漬狀圓形病斑，邊緣不明顯，天氣潮濕時，病斑迅速擴大，可蔓延至整個葉片，表面有明顯的白色霉狀物，引起腐爛，天氣干燥時，病斑變淡褐色，葉片干枯；(3)豆莢發病癥狀:豆莢產生暗綠色水漬狀病斑，邊緣不明顯，后期病部軟化，表面產生白霉；病原菌鑒定方法如下:在培養莖上菌絲體生長茂密；菌絲無隔透明，粗4-7 μm ;菌絲膨大體不規則結節狀。在皮氏液中形成大量孢子囊，孢囊梗不分枝，與菌絲無明顯區別。孢子囊多為卵形，橢圓形或倒梨形，形狀和大小變化較大，在PDA上為21-42 μ mX 10-19 μ m，平均 28.1 μ mX 16.3 μ m，在虹?病英上為 35-57 μ mX 25-38 μ m，平均 53.0 μ mX 33.8 μ m，長寬比值為1.4-2.2，平均1.65 ;絕大多數無乳突或無明顯乳突，平均高0.57 μ m ;成熟后不脫落，具內層出現象。未見厚垣孢子。產生大量有性器官，藏卵器近球形，無色，直徑24-38(平均28.4) μπι。雄器近球形，圍生。卵孢子近球形，淡黃色，平滑，18-25 μ mX 14-24 μ m，平均23.0 μ mX 20.8 μ mD而關于虹疫霉菌的PCR分子檢測國內外尚未見報道，傳統的病原菌檢測方法程序繁瑣，所需時間長，且必須擁有病原菌詳細的分類資料，滿足不了病害控制中快速、靈敏、穩定的檢測要求。因此，建立一套快速、靈敏、準確的豇豆疫霉菌檢測技術非常必要且十分迫切。
[0003]目前，對植物病害的傳統檢測鑒定方法是首先進行病菌分離，通過對已經分離并純化的病菌進行培養，觀察，完成形態上的鑒定工作。同時，將病原菌回接到植株中，進行致病性的驗證。最后，對照已有的分類資料確定引起病害的病原菌的分類和地位。該法作為最基本的病原菌鑒定方法在一直以來被廣泛使用，有著很強實用性，是病原菌的鑒定及病害檢測的方法之一，但是該方法受人為因素和環境的影響，對操作者的實驗技能和實際經驗有很高的要求，十分耗時，無法達到快速檢驗的要求。
[0004]免疫學檢測技術(Immunological technology)具有操作簡單、特異性強，以及檢測時間短的優點，適合開發檢測試劑盒。但其不能對檢測對象進行擴增，所以靈敏度不及核酸檢測技術高。另外，抗體的制作過程耗時、復雜，提高了檢測的成本。這兩點缺點限制了免疫學檢測技術的推廣使用。
[0005]聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain React1n，PCR)是一種利用DNA聚合酶在體外大量擴增靶序列的技術，該技術是病原檢測最常規的方法之一，廣泛應用于病原鑒定、變異檢測等分子生物學研究。PCR檢測技術靈敏度高、特異性強，已成為病原菌檢測重要的技術之一，主要包括常規PCR、巢式PCR (Nest-PCR)和實時熒光定量PCR等，主要的缺點是需要依靠PCR等儀器設備，不利于基層生產上推廣應用。
[0006]環介導等溫擴增(Loop-mediated Isthermal Amplificat1n，LAMP)技術是由日本科學家開發的一種最新的簡便、快速、準確及廉價的核酸高效擴增方法(Notomi et al.，2000)o LAMP技術是一種新型的核酸恒溫擴增方法。該技術在等溫條件下，可在短時間內使產物得到大量擴增，在短短的30min~60min內就能實現109~101(]倍的擴增，同時具有很高的靈敏度和特異性，且操作簡便，檢測結果可肉眼判斷，反應結束后用肉眼觀察是否產生焦磷酸鎂沉淀，即可判斷靶序列是否存在。亦可在反應液中加入熒光指示劑，使反應結果的肉眼觀察更加的方便、直觀和可靠。LAMP技術操作簡單、快速高效，而且檢測特異性非常強，其最大的優勢就是在恒溫條件即可進行擴增反應，無需特殊實驗設備，相較于普通PCR技術，其有很多優點。
[0007]綜上，目前病害檢測方法主要采用傳統的病原分離檢測方法和分子檢測等技術。傳統檢測方法耗時、耗力，且檢測結果可靠性低，免疫學檢測技術的靈敏度較低，且抗體的制作過程耗時、復雜，檢測成本高，PCR技術雖然快速、準確，但需昂貴的儀器設備，檢測成本高，不適宜在基層部門推廣應用。而最近科學家們研發出的環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplificat1n, LAMP)技術是一種高效率的核酸等溫擴增方法，該方法短時間內實現產物的大量擴增，靈敏度比PCR高，且操作步驟簡便，無需特殊設備，檢測結果可由肉眼判斷，極適合于在基層生產部門推廣應用。基于環介導等溫擴增(LAMP)技術，建立豇豆疫霉菌的LAMP檢測技術，根據LAMP技術原理，選取豇豆疫霉菌的核糖體基因上的內轉錄間隔區(Internal Transcribed Spacer, ITS)革巴序列的6個區域，進而設計出4條特異性引物，通過對反應體系和反應條件的優化，以鈣黃綠素(Calcein)的熒光顯色指示劑作用，建立可視化LAMP檢測技術。該體系對豇豆疫霉菌檢測具有高的特異性與靈敏性。該技術是一種操作簡單、靈敏度和特異性高的快速檢測手段；無需特殊儀器設備，同時開發的快速檢測試劑盒適合田間作物生產中開展實地檢測與監測，從而保障作物健康生產及食品安全。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是針對現有技術中豇豆疫霉菌的傳統檢測方法所需周期長、檢測方法特異性差，PCR檢測需要依靠擴增儀等設備，且靈敏度低的問題，提供一種豇豆疫霉菌的LAMP檢測引物以及結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高的檢測方法。
[0009]實現本發明的目的包括下列步驟:
1.LAMP引物的設計
根據豇豆疫霉菌核糖體內轉錄間隔區(rDNA-1TS)序列在疫霉菌種間高度變異和種內穩定性，采用PrimerExplorer V4軟件設計了對5工豆疫霉菌具有特異擴增作用的LAMP檢測引物，包括2條外引物(F3和B3)和2條內引物(FIP和BIP)，引物序列分別為:F3: CTTGGCTCTCTTCCTTCCG ；
B3: TCCTCCATTAAACGCCGC ；
FIP: TTCAAGGGACTCGCAGGCAG-TGTAGTCGGTGGATGGAGAC ；
BIP: TTGCTCGAAAAGCGTGACGTTG-AGCAGACAAACTGGTCGC ；
2.豇豆疫霉菌快速檢測體系的建立
LAMP檢測:25 μ 1反應體系中F3和Β3引物濃度各為0.2 mmol/L，FIP和BIP引物濃度各 1.6 mmol/L, 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4) 2S04，lOmM KCl，8mM MgS04，甜菜堿 0.8 mol/L, Bst 聚合酶為 8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，鈣黃綠素 50 μ mol/L，氯化錳 500 ymol/L,Tffeen-20 0.1%，模板DNA 50-100 ng，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在63-65°C溫育 45-60 min，85°C滅活 5-lOmin。
[0010]所述的檢測方法為熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法。所述熒光染料目測觀察法:在LAMP反應后，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。所述瓊脂糖凝膠電泳法:取2 μ 1 PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0011]該方法可用于帶菌的植株的高靈敏度快速檢測。建立豇豆疫霉菌快速、簡便、特異性強、靈敏度高的監測技術體系，對于豇豆疫病顯癥之前的早期監測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。
[0012]本發明的關鍵性技術是豇豆疫霉菌的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。為了驗證豇豆疫霉菌檢測的特異性，本發明以采集分離的20株豇豆疫霉菌和25種其它疫霉菌或病原真菌為供試材料，對檢測的特異性進行LAMP驗證。
[0013]LAMP檢測:25 μ 1反應體系中F3和Β3引物濃度各為0.2 mmol/L, FIP和BIP引物濃度各 1.6 mmol/L, 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4) 2S04，lOmM KCl，8mM MgS04，甜菜堿 0.8mol/L, Bst 聚合酶為 8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，|丐黃綠素 50 μ mol/L，氯化猛 500 μ mol/L，Tffeen-20 0.1%，模板DNA 50-100 ng，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在63-65°C溫育 45-60 min，85°C滅活 5-lOmin。
[0014]除了 20株豇豆疫霉菌顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳檢測出現LAMP特征性的梯形帶外，檢測了 25種其它疫霉菌或病原真菌菌株的顯色結果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現擴增條帶。這說明該引物可被用于生產實踐中豇豆疫霉菌快速可靠的檢測和鑒定。
[0015]當在用于豇豆組織中存在疫霉病菌的檢測時，采用NaOH快速裂解法提取豇豆疫霉菌的DNA，具體過程如下:(1)將豇豆病葉或病莖洗凈、晾干，剪取發病部位；(2)按lmg病葉加入1