一種豬偽狂犬病毒的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于家畜疾病診斷技術領域，具體涉及一種豬偽狂犬病毒檢測方法。
【背景技術】
[0002] 豬偽狂犬病（PseudorabiesPR)是由豬偽狂犬病病毒（PseudorabiesvirusPRV) 引起的豬、牛、羊等多種家畜及野生動物的一種高度接觸性、急性傳染病。豬是PR主要的 天然宿主和最主要的傳染源。各年齡階段的豬只均可被感染，該病在豬群多呈暴發性流 行，給我國乃至全球的養豬業帶來了巨大的經濟損失。目前，主要依靠接種gE基因缺失的 Bartha-K61弱毒疫苗來預防本病。但是2011年以來我國多省份出現了新的毒力更強變異 毒株，造成了很大的經濟損失，即使接種的豬只也不能幸免于難，出現了不同年齡段豬的死 亡。表明Bartha-K61弱毒疫苗已經不能提供完全的保護力。
[0003] 而且，由于病毒基因組很容易發生變異，導致已有的用于檢測的抗體失去效果，這 就加大了對于PRV進行正確診斷的困難，因此迫切需要建立一種特異性高的PRV進行鑒別 診斷的方法，從而為PR正確診斷提供科學的手段。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種豬偽狂犬病毒的檢測方法，用本發明制備的針對PRV gE 蛋白的高特異性單克隆抗體，基于該單抗建立的阻斷ELISA方法具有特異性高、靈敏度強、 無假陽檢測的特點，從而為PR準確診斷提供科學的依據。
[0005] 本發明首先提供一種具有新的具有良好免疫原性的gE蛋白，較以前報道的PRV的 gE蛋白，在第48位和第492~496位各有1個天冬氨酸的插入，該區域恰好處于gE蛋白抗 原表位所處的結構域中，氨基酸的插入很可能改變了已知毒株存在的抗原表位，造成其致 病性增強，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1 ;
[0006] 編碼上述gE蛋白的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO: 2;
[0007] 上述的gE蛋白作為抗原用于制備抗體；
[0008] 本發明再一個方面提供一種檢測患病豬群抗體的阻斷ELISA方法，包括如下的具 體步驟：
[0009] 將gE蛋白抗原經過稀釋液稀釋，定量包被在ELISA 96孔板中，4°C過夜；
[0010] 用PBST洗滌液對未結合的抗原進行清洗；
[0011] 分別將陰性血清、陽性血清和待檢血清加到相應的檢測孔中，輕微震動，使反應板 中的液體混勻；
[0012] 將微量反應板密封后置于37°C孵育；
[0013] 垂直倒掉反應板中的液體，并用洗滌液進行對每個孔進行清洗；
[0014] 用封閉液對反應板進行封閉，置于37°C孵育；
[0015] 去除反應板中的液體，并用洗滌液進行對每個孔進行清洗；
[0016] 將稀釋好的酶標單抗加入到每個反應孔中，置于37°C孵育；
[0017] 倒掉反應板中的液體，并用洗滌液進行對每個孔進行清洗；
[0018] 添加底物，置于37 °C中反應；
[0019] 加入終止液，終止反應，并于酶標儀讀取450nm吸光度值，樣品值/陰性值大于2 判定為陽性，小于1為陰性。
[0020] 其中陰性血清的制備方法為：未經免疫小鼠血清為陰性血清；
[0021 ] 陽性血清是gE蛋白免疫小鼠的分離血清。
[0022] 所述的封閉液為：5%脫脂奶粉
[0023] 洗滌液為：含0·5%。吐溫-20的PBS溶液；
[0024] 所使用的酶標單抗，其制備方法為：
[0025] 將用于酶標的單克隆抗體進行純化后，對單克隆抗體進行辣根過氧化物酶（HRP) 進行酶標，具體步驟如下：
[0026] 稱取5mg HRP溶于0· 5ml蒸餾水中；
[0027] 加入0· 5ml0· 06MNaI04,4°C輕搖30min，溶液呈現黃綠色；
[0028] 加入0. 5ml0. 16M乙二醇，室溫下避光輕搖30min，終止氧化反應；
[0029] 加入5mg抗體，裝入透析袋中，置于0· 05M，pH為9. 6的碳酸鹽緩沖液（CBS)中， 4°C透析過夜，期間更換至少3次CBS;
[0030] 取出透析袋中的液體，加入5mg/mlNaHB40. 2ml，4°C過夜；
[0031] 加入等體積飽和硫酸銨溶液沉淀結合物，4°C30min后，3000rpm離心15min，丟棄 上清；
[0032] 將沉淀物溶于PBS中，裝入透析袋中，并以PBS為緩沖液透析6-12h，更換3次透析 液；
[0033] 最后，將獲得的液體-20 °C分裝保存。
[0034] 終止液為：2MH2S04。制備方法是蒸餾水178. 3ml，逐滴加入濃硫酸21. 7ml。
[0035] 本發明的通過制備具有特異性高的單克隆抗體，并建立基于該單克隆抗體檢測PR 毒株的方法，從而對目前流行的PR毒株具有良好的鑒別診斷的作用。
【具體實施方式】
[0036] 下面結合具體實施例來進一步對本發明進項詳細描述，本領域的普通技術人員在 本發明技術方案的基礎上，可以選用本領域常用的方法步驟，而不僅限于本發明說明書實 施例的具體記載。
[0037] 實施例1 :PRV主要抗原gE基因質粒的克隆、轉化以及表達載體的構建
[0038] 采用生物信息學方法，并結合相關的文獻報道，本發明選取了gE基因包含主要抗 原位點膜外區域lbp~1275bp共計1275bp的基因序列進行擴增，擴增采用的模版DNA為 本實驗室經過前期優選并送往菌種包藏中心編號為CGMCCNo. 10266毒株。
[0039] PCR擴增后得到1275bp的目的片段，并將其與pMD-19T載體連接，測序正確后，經 過BamHI和Xhol雙酶切后，膠回收后將其連接到經過相同酶切的pGEX-6p-l表達載體上， 測序正確后命名為pGEX-gE進行菌種保存，并用于下游實驗。對質粒進行測序得到目的片 段的核苷酸序列為SEQ IDN0:1，編碼的氨基酸序列為SEQ IDN0:2;
[0040] 對新分離的gE核苷酸序列進行比對其與以前分離的毒株的親緣關系相對較遠。 gE基因第48位和第492~496位各有1個天冬氨酸的插入。而以前分離到的毒株只個別 有一個位置插入氨基酸，絕大部分沒有插入。這很可能是現有疫苗不能提供完全保護的原 因所在。
[0041] 表1 :擴增中用到的引物
[0042]
[0043] 實施例2 :gE基因的原核蛋白表達、分析與純化
[0044] 將重組質粒pGEX-gE轉化表達感受態BL21 (DE3)，挑取K+LB平板上的白色單菌落， 接種于5ml含A+的LB培養液中37°C過夜培養。次日，將菌液按1 :100比例接種于含K+的 LB培養液中，37°C搖床振蕩培養至0D_Ji到0. 4~0. 6時，并對表達的溫度、IPTG誘導濃 度、誘導時間等條件進行摸索以確定蛋白的最優表達條件。將表達的蛋白經過SDS-PAGE表 達情況的分析，并經瓊脂糖擴散實驗對表達蛋白的抗原性進行分析。大量擴增目的蛋白，并 利用GST蛋白純化試劑盒對可溶性蛋白進行純化，并通過BCA試劑盒以及nanodrop2000 對蛋白含量進行測定。
[0045] 實施例3 :單克隆抗體的制備
[0046] L動物免疫
[0047] 以純化后的原核表達重組蛋白gE為免疫原，免疫4~6周齡雌性Balb/c小鼠。共 免疫3次，每次間隔兩周。一免將純化后的重組蛋白gE蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合 乳化，免疫途徑為皮下免疫；第二、三次免疫均將純化gE與等體積的弗氏不完全佐劑混合 乳化，免疫途徑為腹腔免疫。三次免疫劑量均為1〇〇μg/只。細胞融合前3d，對免疫效果好 的Balb/c小鼠腹腔注射100μg純化gE蛋白（不加佐劑），進行加強免疫。
[0048] 2.PRV純化
[0049] 將PRV接種Vero細胞，Μ0Ι= 1。37°C溫箱孵育，48h~72h后收獲細胞。
[0050] 將收獲的細胞反復凍融三次后，4°C4OOOrpm離心30min，繼而再8OOOrpm離心 60min，棄沉淀。
[0051] 將收集的上清超速離心，4°C25OOOrpm離心lh30min，棄上清。
[0052] 用適量的PBS溶解沉淀，經20 %、40 %和60 %蔗糖密度梯度4°C30OOOrpm離心 2. 5h，棄上清。
[0053] 再次用適量的PBS溶解沉淀，4°C100 000g離心3h進行脫糖，棄上清。
[0054] 加入適量PBS溶解沉淀，分裝保存于_70°C。按BCA方法測其濃度。
[0055] 3.間接ELISA方法的建立
[0056] 將二、三次免疫后7~9d小鼠斷尾采血，分離血清。以蔗糖密度梯度純化的PRV 為抗原、以免疫鼠血清為陽性血清、未免疫鼠血清為陰性血清，建立篩選雜交瘤細胞的間接 ELISA檢測方法。具體步驟如下：
[0057] 用CBS緩沖液將純化后PRV以10μg/ml的濃度開始做2倍梯度稀釋，100μ1/孔， 4 °C包被過夜；
[0058] 棄包被液，PBST振蕩洗板3次，3min/次，拍干；
[0059] 加含5%脫脂乳的PBS封閉，200μ1/孔，37°C孵育2h后如上述方法洗板；
[0060] 將小鼠陰陽性血清做1:100、1:200、1:400、1:800倍稀釋，100μ1/孔，同時設空白 對照。37°C作用lh后洗板；
[0061] 將羊抗鼠HRP-IgG做20 000倍稀釋，100μ1/孔，37°C作用45min后洗板；
[0062] 每孔加100μ1TMB顯色液，37°C避光顯色15min。2MH2S04(50μ1/孔）終止反應 后，于酶標儀測定0D45Qnn/(E〇
[0063] 4.細胞融合
[0064] 1)飼養層細胞的制備
[0065] 細胞融合前ld，將8~12周齡健康未免疫BALB/c小鼠眼球采血致死，分離得到的 血清可作為陰性對照。置75%酒精中浸泡5min，放于生物安全柜固定；
[0066] 用無菌鑷子提起其腹部皮膚，小心將此處剪開并頓性剝離，使腹膜充分并完整地 暴露。同時用酒精棉球輕輕擦拭消毒；
[0067] 用一次性無菌注射器吸取5mlDMEM基礎培養液注入小鼠腹腔，固定注射器并用酒 精棉球輕輕按摩其腹部l-2min。隨后吸出腹腔中的培養液注入HAT培養液中。
[0068] 將細胞混勻后加到96孔細胞培養板中，100μ1/孔。將96孔細胞培養板置于 37°C，5% (：02培養箱中培養。
[006