一種凝乳酶的貯藏方法及可常溫儲存的凝乳酶液的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種凝乳酶的貯藏方法以及一種可常溫貯藏 的凝乳酶液。
【背景技術】
[0002] 眾所周知，酶作為一種生物催化劑，其半衰期短、易失活這些不足將嚴重影響著酶 的使用效果。這些不足產生很大程度上是由于酶存在自身降解的現象，有研究報道，由細 菌產生的中性蛋白酶存在自身降解的現象。這一現象不僅影響酶類的結構鑒定，而且導致 酶活降低甚至消失，對酶類的分離純化、保存及生產應用帶來困難，凝乳酶的應用也存在同 樣的困境。所以，如何提高凝乳酶的儲存穩定性，尤其是如何在常溫保證凝乳酶的活力，從 而擴大酶的應用范圍成為當今國內外亟待解決的難題。這也要求我們探索一種新的貯藏方 法，能在常溫條件下有效地抑制凝乳酶的自身降解，從而實現凝乳酶常溫下的有效貯藏。
[0003] 微生物來源的凝乳酶以其產量大、成本較低、方便提取、不受地域影響的優勢，越 來越廣泛的應用于干酪工業化生產。國外一些公司已利用改良的菌種生產出高活力的凝乳 酶，創造了巨大的經濟效益，而我國干酪生產中使用的凝乳酶絕大部分尚依賴進口。因為目 前為止，國內雖然已有大量研究篩選不同來源的高產凝乳酶的菌株、優化菌種發酵條件及 分離純化條件，并分析其酶學性質，但如何在常溫下貯藏凝乳酶，并有效保存凝乳酶的活性 尚且在探索之中，成為長期困擾國內公司的難題，造成現階段國內生產的凝乳酶無法走向 市場，無法被有效利用。
[0004] 在工業化酶制劑中，貯藏中凝乳酶的穩定性是開發應用中一個關鍵因素。酶的穩 定性不僅僅可以影響酶的貨架期，而且可以影響到酶的作用時間。常溫條件下，凝乳酶穩定 性提高，除了貯藏時間延長，便于運輸銷售之外，更能延長酶作用時間，提高生產效率，從而 有效地降低生產成本。當前，提高酶穩定性主要的方法有：蛋白質工程、化學修飾、酶的固定 化和添加保護劑等。在液體酶中直接加入保護劑是一種常用的經濟、有效的方法。
[0005] 可產生一定活力的凝乳酶的微生物包括放線菌中鏈霉菌屬、根霉、毛霉、粟疫菌及 其他通過基因工程或輻照獲得的高產凝乳酶的菌株等。中國專利申請CN103740618A公開 的類芽孢桿菌屬的一個新菌種Paenibacillusdamxungensissp.ηον·(保藏編號為：CGMCC No. 8333)，即類芽孢桿菌BD3526菌株，該菌株發酵液具有一定的凝乳活力，經過提取即可 得到凝乳酶。通過麩皮培養BD3526發酵制備的凝乳酶，在常溫貯藏過程中極易失活，半衰 期短，如初始凝乳酶活8000SU/mL的溶液，其酶活半衰期約為30min，且失活時間與初始凝 乳酶活具有相關性。因為通過類芽孢桿菌發酵產生的凝乳酶在常溫保存十分困難，從而制 約類芽孢桿菌BD3526發酵產生的凝乳酶在干酪工業化生產中的應用，因此，開發一種利用 保護劑來維持類芽孢桿菌凝乳酶穩定性的貯藏方法既經濟，操作又方便，適合大規模應用， 正是國內相關產業所急需的，高效方便的方法。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是針對現有常溫貯藏過程中，類芽孢桿菌BD3526所產 凝乳酶存在的自身降解，極易失活，半衰期短，不能常溫貯藏等缺陷，提供了一種凝乳酶的 貯藏方法及可常溫貯藏的凝乳酶液，該貯藏方法能在常溫下有效保存類芽孢桿菌BD3526 所產凝乳酶的活性，從而保證了類芽孢桿菌所產凝乳酶的后續有效利用。
[0007] 本發明人經過廣泛的研究和反復的試驗，發現通過改變類芽孢桿菌所產凝乳酶液 中鈣離子濃度，能夠長久的維持凝乳酶活力。進一步地，發現類芽孢桿菌所產凝乳酶在鈣離 子溶液中，在常溫條件下保存，即可長久的維持凝乳酶活力，從而完成了本發明。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案之一是，一種凝乳酶的貯藏方法， 所述貯藏方法包括以下步驟：取CaCl2加入凝乳酶液中混合，所述凝乳酶液由保藏編號為 CGMCCNo. 8333的類芽孢桿菌BD3526發酵液上清中提取得到。
[0009] 本發明中，所述混合是本領域常規的方法，較佳地為經攪拌混合均勻。
[0010] 本發明中，所述凝乳酶液較佳地由麩皮培養基培養保藏編號為CGMCCNo. 8333的 類芽孢桿菌BD3526發酵液上清中提取得到。所述由麩皮培養基培養培養條件為常規培養 條件（詳見公開號為CN103865842A的中國專利申請），較佳地采用搖床震蕩培養，震蕩速度 為常規的，較佳的為160r/min，培養溫度為常規的，較佳地為20°C~40°C，更佳地為25°C~ 35°C，最佳地為30°C，培養時間較佳的為72小時（h)。所述麩皮培養基為常規的，較佳包括 小麥麩皮和水，其中小麥麩皮的含量較佳為1 %~14 %，更佳地為2 %~5 %，最佳地為3 %， 所述百分比為質量百分比。
[0011] 本發明所述小麥麩皮培養基的主要成分較佳地為：蛋白質13. 9~18. 6%，脂肪 3. 3~8. 2 %，總碳水化合物61. 9~74. 62 %，水分4. 8~18. 02 %，灰分3. 38~6. 50 %，所 述百分比為質量百分比（詳見公開號為CN103865842A的中國專利申請）。
[0012] 本發明中，所述凝乳酶液提取方法為常規的，較佳地為利用硫酸銨沉淀法從由麩 皮培養基培養的保藏編號為CGMCCNo. 8333的類芽孢桿菌BD3526發酵液上清中提取而來。
[0013] 本發明中，所述CaCl2可由常規方法制備，優選地由包括以下步驟的方法制備而 得：取CaCl^體粉末，并使用去離子水進行溶解，制備得到的不同濃度的CaCl2溶液，即可 作為金屬蛋白酶保護劑（可簡稱金屬酶保護劑），用于維持類芽孢桿菌BD3526所產凝乳酶 (一種金屬蛋白酶）的穩定性，保護類芽孢桿菌所產凝乳酶的活性。
[0014] 本發明所述貯藏方法中，所述混合后0&(：12的濃度較佳地為2. 5~100mm〇l/L，更 佳地為50~100mmol/L，最佳地為50~75mmol/L。
[0015] 本發明所述的貯藏方法的貯藏溫度較佳的在0~40°C范圍內，即可保證酶活力維 持較高水平，更佳的貯藏溫度為4~40°C，最佳地為4~25°C。
[0016] 本發明所述貯藏方法可長時間維持類芽孢桿菌所產凝乳酶活力，較佳的維持時間 為0~720小時。
[0017] 本發明所述的類芽孢桿菌凝乳酶的貯藏方法的一較佳的實例包括以下步驟：
[0018] 1)將保藏編號為CGMCCNo. 8333的類芽孢桿菌BD3526接種于麩皮培養基進行發 酵，得發酵液；
[0019] 2)利用硫酸銨沉淀方法，提取步驟1)所述的發酵液的上清中的凝乳酶，獲得類芽 孢桿菌凝乳酶液；
[0020] 3)取0&(：12固體粉末，用去離子水溶解，獲得CaCl2溶液，即為金屬蛋白酶保護劑；
[0021] 4)將步驟3)所述的金屬蛋白酶保護劑加入步驟2)所述的類芽孢桿菌凝乳酶液 中，攪拌均勻，貯藏于常溫下即可。
[0022] 為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案之二是，一種可常溫貯藏的凝乳酶 液，所述可常溫貯藏的凝乳酶液包括CaCljP凝乳酶，所述類芽孢桿菌凝乳酶由保藏編號 為CGMCCNo. 8333的類芽孢桿菌BD3526發酵液上清中提取得到。
[0023] 本發明中，所述的可常溫貯藏的凝乳酶液還可以包括常規的載體，包括水，或者 PBS，或者生理鹽水等。
[0024] 本發明中，所述凝乳酶較佳的制備方法同上述凝乳酶液的制備方法。
[0025] 本發明中，所述的CaCl2的濃度較佳為2. 5~100mmol/L，更佳地為50~lOOmmol/ L，最佳地為50~75mmol/L。
[0026] 本發明中，所述的可常溫貯藏的類芽孢桿菌凝乳酶液貯藏溫度較佳的在0~ 40°C(即常溫）范圍內，可保證酶活力維持較高水平，更佳的貯藏溫度為4~40°C，最佳地 為4~25°C。
[0027] 本發明中，所述的可常溫貯藏的凝乳酶液可長時間維持凝乳酶活力，較佳的維持 時間為〇~720小時。
[0028] 本發明所述可常溫貯藏的凝乳酶液可由CaCljP凝乳酶經常規方法混合而成，所 述凝乳酶液由保藏編號為CGMCCNo. 8333的類芽孢桿菌BD3526發酵液上清中提取得到；較 佳的制備方法同前述貯藏方法：取CaCl2加入凝乳酶液中混合而得到，所述凝乳酶液由保藏 編號為CGMCCNo. 8333的類芽孢桿菌BD3526發酵液上清中提取得到。
[0029] 本發明所涉及的常溫均為0~40°C。
[0030] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實 例。
[0031] 本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0032] 本發明提供了一種凝乳酶的貯藏方法，其有益效果在于，類芽孢桿菌BD3526所產 凝乳酶液與金屬酶保護劑CaCV混合，可有效維持類芽孢桿