Est-ssr標記鑒定中藥溪黃草品種的方法和引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子標記與藥材鑒定技術領域，特別是涉及利用EST-SSR標記鑒定中 藥溪黃草品種的方法和引物。
【背景技術】
[0002] 中藥溪黃草為民間習用草藥，為唇形科（Lamiaceae)香茶菜屬（Isodon)植物，主 產于長江以南的湖南、湖北、四川、云南、江西、廣東、廣西、福建等省區。喜生于山谷陰濕溪 旁，新鮮葉片搗碎有黃汁而得名。其性味苦、甘、寒，歸肝、膽經，具有清熱利濕、涼血散瘀、退 黃等功效。溪黃草在廣東各地臨床應用非常普遍，主要用于治療急性黃疸型肝炎、急性膽囊 炎、濕熱痢疾、腸炎、跌打瘀腫和養生保健等。現已開發出多種以其為主要原料的保健品和 中成藥，如溪黃草沖劑、溪黃草袋泡茶、消炎利膽片、復方膽通等，對護肝利膽、抗腫瘤有著 顯著的作用。此外，溪黃草是廣式涼茶的重要成分，是嶺南地區居民較常飲的涼茶之一。然 而，國內對溪黃草的開發利用率相對較低，不夠深入；產品質量不穩定，與近幾年溪黃草種 植迅速發展極不適應，在某種程度上制約了該產業的進一步發展，究其原因很可能與其存 在品種混淆的問題密切相關。
[0003]目前，溪黃草藥材基源品種多，極易混淆是中藥溪黃草在生產和臨床上 面臨的較突出問題之一。據新版《廣東省中藥材標準》（2010)記載中藥溪黃草常 用的基源植物有4種，分別是溪黃草[Isodon.serra(Maxim.)Kudo]、線紋香茶菜 [I.lophanthoides(Buch. -Ham.ExD.Don)H.Hara]、狹基線紋香茶菜[I.lophanthoidesvar. gerardiana(Benth.)H.Hara]和纖花（細花）線紋香茶菜[Ι·lophanthoidesvar. graciliflora(Benth. )H.Hara]，但是各藥典記載并不統一，如：《中華人民共和國藥典》 (2010版）中記載的基源植物是線紋香茶菜或溪黃草的干燥地上部分；《常用中草藥手冊》 (1969)、《全國中草藥匯編》（2014)記載的基源植物為線紋香茶菜。此外，藥材市場上用作 中藥溪黃草的植物非常混亂，廣州清平市場上的不下十幾種，除同屬植物全部作中藥溪黃 草用外，還有其它不同科植物，造成溪黃草藥材的植物來源更加混亂。
[0004]中藥溪黃草民間常用的鑒定標準是"生溪邊，有無黃汁和紅色腺點"等。溪黃草 (I.serra.)的腺體幾乎透明無色，揉之無黃色汁液；線紋香茶菜、狹基線紋香茶菜、纖花線 紋香茶菜和小花線紋香茶菜在顯微鏡下能看到密布的紅色腺體，揉之有黃色液體，紅色腺 體也是造成溪黃草揉搓之后有黃汁的根本原因。許多學者根據這個特點，判定線紋香茶菜 才是溪黃草的正品，但仍有專家學者認為市場上的狹基線紋香茶菜基本為纖花線紋香茶 菜，且《全國中草藥匯編》中記載的線紋香茶菜也是纖花線紋香茶菜。這表明，現行中藥溪 黃草的品種鑒定標準在經典分類中仍存在較大分歧。
[0005] 為解決溪黃草品種混淆問題，很多學者對溪黃草各基源植物進行了多方面的鑒定 研究，主要集中在形態鑒別、顯微鑒別、化學成分鑒別等方面，利用分子手段鑒定報道還較 少。溪黃草各基源植物在葉形、葉面腺點、葉表皮細胞、花粉粒形態、腺毛形態及化學成分等 都有所差別，在分子鑒定方面，曾有研究者先后利用RAH)技術對中藥溪黃草類進行鑒定研 究，篩選出了多個擴增產物重復性好的引物，并通過聚類分析，發現狹基線紋香茶菜和纖花 香茶菜與線紋香茶菜的親緣關系較近，而溪黃草與線紋香茶菜和纖花香茶菜之間的親緣關 系更遠。雖然以上研究在溪黃草品種的分子分類取得了一定的進展，但溪黃草的品種鑒定 標準非常復雜，需要綜合溪黃草形態（如葉的形狀、葉表面腺點、花粉粒等）、化學成分分析 和藥理藥效等數據進行綜合性鑒別。近年來，溪黃草在廣東各地臨床應用普遍，狹基線紋香 茶菜和溪黃草（I.serra.)是廣東省市場主流商品，然而不同種質來源的溪黃草藥材藥效 差異較大，雖然目前較公認的是線紋香茶菜在藥效成分上最佳，但臨床上仍在用較次的溪 黃草（I.serra.)或其它品種，究其原因還是在于溪黃草種質與藥材質量問題未得到有效 解決。因此，需尋找更加適宜的鑒定方法對溪黃草進行有效鑒別。
[0006] 伴隨著分子生物學的飛速發展，利用現有大量表達序列標簽ESTs(Express SequenceTags，ESTs)數據庫來開發簡單序列重復序列（SSR)已經成為植物遺傳研究中頻 繁選擇使用的主要的分子標記之一。相比于RAPD，AFLP以及ISSR這一類顯性分子標記而 言，EST-SSR作為共顯性分子標記，能夠與植物物種某些表達不同的功能基因相聯系，因此 可以更加明確物種種間和種內的遺傳差異，現已廣泛應用于各種植物的研究中。然而，溪黃 草目前的研究極少涉及分子領域，各數據庫中的信息資料十分匱乏。因此，構建溪黃草轉錄 組庫，在此基礎上開發出EST-SSR標記，對中藥溪黃草各基源植物和市場及生產上常用的 種類進行分子鑒定研究，建立溪黃草主要種質來源的指紋圖譜和品種鑒定技術體系，揭示 遺傳多樣性水平和群體遺傳結構特點具有重要意義，可為溪黃草資源保護及種質創新提供 參考。
【發明內容】
[0007] 基于此，本發明的目的之一在于提供一種利用EST-SSR標記鑒定中藥溪黃草的品 種的方法。
[0008] 具體技術方案如下：
[0009] 一種利用EST-SSR標記鑒定中藥溪黃草的品種的方法，包括以下步驟：
[0010] ⑴提取待測樣品基因組的DNA;
[0011] ⑵以步驟⑴提取的DNA為模版，用基于溪黃草轉錄組序列的EST-SSR核心引 物組進行PCR擴增，得到不同長度的擴增產物；所述EST-SSR核心引物組包括下述24對 引物中的至少10對，每對引物由上游引物和下游引物組成，每對引物的核苷酸序列分別 為SEQIDNO. 1-SEQIDN02、SEQIDNO. 3-SEQIDN04、SEQIDNO. 5-SEQIDN0. 6、SEQ IDN0.7-SEQIDN0.8、SEQIDN0.9-SEQIDNO. 10、SEQIDNO. 11-SEQIDNO. 12、SEQID NO. 13-SEQIDNO. 14^SEQIDNO. 15-SEQIDNO. 16^SEQIDNO. 17-SEQIDNO. 18^SEQID NO. 19-SEQIDNO. 20^SEQIDNO. 21-SEQIDNO. 22^SEQIDNO. 23-SEQIDNO. 24^SEQID NO. 25-SEQIDNO. 26^SEQIDNO. 27-SEQIDNO. 28^SEQIDNO. 29-SEQIDNO. 30^SEQID NO. 31-SEQIDNO. 32^SEQIDNO. 33-SEQIDNO. 34^SEQIDNO. 35-SEQIDNO. 36^SEQID NO. 37-SEQIDNO. 38^SEQIDNO. 39-SEQIDNO. 40^SEQIDNO. 41-SEQIDNO. 42^SEQID N0·43-SEQIDN0·44、SEQIDN0·45-SEQIDN0·46、SEQIDN0·47-SEQIDN0·48，其中編號為奇數的核苷酸序列為上游引物，編號為偶數的核苷酸序列為下游引物；所述PCR擴增 所用的引物還包括一個5'端用熒光標記的通用M13引物，所述通用M13引物的序列為SEQ IDNO. 49 ；
[0012] (3)對步驟（2)所得不同長度的擴增產物進行測序分型。
[0013] 在其中一個實施例中，步驟（2)所述EST-SSR核心引物組包括上述24對引物。用 上述10對以上的引物即可對溪黃草常見的藥材基源植物品種進行鑒別，24對引物一起用， 鑒別效果更好，結果更準確。
[0014] 在其中一個實施例中，步驟（1)所述的基于溪黃草轉錄組序列的EST-SSR核心引 物組由以下方法篩選得到：提取溪黃草藥材基源植物的RNA并測序拼接，構建EST序列， 搜索EST序列中的SSR位點，針對SSR位點設計、合成目標引物，對所合成的目標引物進行 PCR擴增，再對擴增產物通過毛細管電泳與GeneMarker軟件進行分型與條帶判別，篩選得 到EST-SSR核心引物組。
[0015] 在其中一個實施例中，SSR位點的搜索限制條件為：二堿基重復至少6次；三堿基、 四堿基、五堿基或六堿基重復至少5次；兩個SSR位點之間如果小于100bp則視為復合型 SSR〇
[0016] 在其中一個實施例中，設計目標引物的主要參數為：引物長度為18_25bp，退火溫 度為57-63 °C，GC含量為40-70%，PCR產物的長度為100-300bp。
[0017] 本發明的另一目的在于提供一種基于溪黃草轉錄組序列的EST-SSR核心引物組。
[0018] 具體技術方案如下：
[0019] 一種基于溪黃草轉錄組序列的EST-SSR核心引物組，包括下述24對引物中的 至少10對，每對引物由上游引物和下游引物組成，每對引物的核苷酸序列分別為SEQ IDNO. 1-SEQIDN02、SEQIDN0.3-SEQIDN04、SEQIDN0.5-SEQIDN0.6、SEQIDN0.7-SEQ IDN0.8、SEQIDN0.9-SEQIDNO. 10、SEQIDNO. 11-SEQIDNO. 12、SEQIDNO. 13-SEQID NO. 14^SEQIDNO. 15-SEQIDNO. 16^SEQIDNO.