一種表達施馬倫貝格病毒重組n基因桿狀病毒的制備、鑒定方法以及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于一種桿狀病毒的制備、鑒定及其應用技術領域，具體為一種 Vh〇"d-SBV-N桿狀病毒的制備、鑒定及其應用技術領域。
【背景技術】
[0002] 施馬倫貝格病毒英文縮寫：SBV，施馬倫貝格病毒病是一種新發的、流行于歐洲的 動物傳染病。SBV可引起牛、山羊、綿羊、野牛等動物發病，主要通過庫朦傳播，也可通過胎盤 垂直傳播。主要的臨床癥狀表現為發熱、腹瀉、乏力、死胎、崎形胎、產奶量下降、新生幼畜先 天缺陷等臨床癥狀。SBV嚴重影響牲畜生產性能，危害畜牧業發展。歐洲是我國種畜引進及 畜產品進口的主要來源地區之一。鑒于SBV可能對我國畜牧業帶來的巨大經濟損失，研究 該病毒的檢測方法具有重要意義。
【發明內容】
[0003] 本發明通過將SBVN基因重組于昆蟲桿狀病毒表達載體基因中，并將其在昆蟲細 胞中成功表達。表達蛋白的獲得為該病毒相應檢測方法的研究奠定了物質基礎。
[0004] 本發明中Vh^id-SBV-N桿狀病毒指的是表達施馬倫貝格病毒N蛋白的桿狀病毒。
[0005] 本發明采用如下技術方案實現。
[0006] 一種制備Vbacmid-SBV-N桿狀病毒方法，步驟如下：
[0007] 1)參照NCBI上公布的施馬倫貝格病毒：SBV的N基因開放閱讀框序列設計了一對 含特異性酶切位點的引物，擴增SBVN基因；
[0008] 2)將擴增的SBVN基因克隆于昆蟲桿狀病毒表達載體pFas巧acHTB;
[0009]如W步驟2得到的質粒轉化DHlOBac感受態細胞，得到重組穿梭質粒 Bacmid-SBV-N；
[0010] 4)將步驟3得到的重組穿梭質粒Bacmid-SBV-N在脂質體介導下轉染S巧昆蟲細 胞，得到Vbacmid-SBV-N的桿狀病毒。
[0011] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的鑒定方法，步驟為，取Vbacmid-SBV-N桿狀病毒， 按1:1~1:10的比例感染Sf9昆蟲細胞，27°C培養96h~12化后，取培養的病毒上清液， 通過SDS-PAGE方法進行病毒鑒定：使用Bio-Radmini電泳儀，參照Bio-Radmini電泳儀 操作手冊說明書，對培養的病毒上清液進行SDS-PAGE電泳，同時做兩塊凝膠，一塊用于染 色分析，另一塊用于Westernblot分析。SDS-PAGE電泳后，蛋白質分子量在29. 6邸處出現 一條特征性的條帶。
[0012] 通過SDS-PAGE方法進行病毒表達特征蛋白鑒定后，再通過Western blot方法對 病毒表達特征蛋白進行鑒定：用Bio-Rad轉膜儀將SDS-PAGE凝膠電泳的各蛋白條帶轉移至 固相載體硝酸纖維素膜上，W抗SBV核蛋白的單克隆抗體1F2 (1:1000倍稀釋）為一抗，羊 抗鼠IgG-HRP(1:3000倍稀釋）為二抗做Western blot分析，蛋白質分子量在29. 6邸處出 現一條特征性的條帶。
[001引一對制備Vbacmid-SBV-N桿狀病毒使用的引物，SBVF: 5' -TTAGGATCCATGTCAAGCCAATTCA-3' ;SBVR:5' -ATTCTGCAGCGTTAGATGTTGATACCGA-3'。
[0014] 一對制備Vbacmid-SBV-N桿狀病毒使用的引物的酶切位點，SBVF的酶切位點為 GGATCC;SBVR的酶切位點為CTGCAG。
[0015] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應用為，Vbacmid-SBV-N桿狀病毒穩定表達SBV的 核蛋白：N蛋白。
[0016] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應用為，Vbacmid-SBV-N桿狀病毒與抗SBVN蛋 白的單克隆抗體存在免疫學反應。
[0017] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應用為，利用Vbacmid-SBV-N桿狀病毒表達的SBV 核蛋白，作為SBV抗體檢測中酶聯免疫吸附試劑制備中的包被用抗原。
[0018] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應用為，利用Vbacmid-SBV-N桿狀病毒表達的SBV 核蛋白，作為SBV抗體檢測中，膠體金試紙條制備中的金標物質。
[0019] 本發明的有益效果為，發明人基于昆蟲桿狀病毒表達系統優于原核表達系統的優 點一-表達外源蛋白時具有完備的翻譯后加工修飾能力，開展了SBV核蛋白在昆蟲細胞上 的表達。在表達SBV蛋白的過程中，發明人為了控制轉染過程中試劑、操作等因素造成的誤 差，在轉染時，W實驗室前期構建的Bacmid-GFP作為陽性對照，轉染后通過觀察綠色巧光 蛋白的表達證明轉染過程的可靠性，最終發明人通過蛋白電泳、免疫印跡的方法表明實驗 獲得了具有生物活性的SBVN蛋白，準確地鑒定了Vhemid-SBV-N桿狀病毒。
[0020] 下面就附圖和【具體實施方式】對本發明做進一步解釋。
【附圖說明】
[0021] 圖 1 重組質粒SBV-N的PCR擴增圖（Fig. 1PCRamplificationofrecombinant plasmidSBV-腳
[0022] 其中：M.DM標準DL2000 ; 1-4.SBV-N引物SBVF/SBVR擴增片段（M.DMMarker DL2000;l-4.PCRproductsofrecombinantplasmidSBV-NwithSBVF/SBVRprimers);
[0023] 圖 2 重組質粒pMDlST-SBV-N的PCR擴增圖（Fig. 2PCRamplificationof recombinantplasmidpMDlST-SBV-N)
[0024]其中：M.DM標準DL2000 ; 1-2.pMDlST-SBV-N引物SBVF/SBVR擴增片段（M.DM MarkerDL2000 ; 1-2.PCRproductsofrecombinantplasmidpMD18T-SBV-NwithSBVF/ SBVRprimers)；
[00巧]圖 3 重組質粒pFas1:BacHTB-SBV-N的酶切鑒定圖（Fig. 3Identificationofthe recombinantplasmidofpFastBacHTB-SBV-Nbyenzymedigestion)
[0026]其中：M.DM標準MarkerIV;1.pFas巧a地TB-SBV-N經BamI和PstI雙酶切 (M.DNAMarkerIV; 1.Restrictionenzymeidentificationofrecombinantplasmid pFas巧a地TB-SBV-NbyBamI&PstI);
[0027]圖 4 重組穿梭質粒Bacmid-SBV-N的PCR擴增圖（Fig. 4PCRamplificationof recombinantshuttleplasmidBacmid-SBV-N)
[0028]M.DNA標準DL2000 ; 1-5.Bacmid-SBV-N引物SBVF/SBVR擴增片段
[002引（Μ.DNAMarkerDL2000;1-5.PCRproductsofrecombinantplasmid Bacmid-SBV-NwithSBVF/SBVRprimers)；
[0030] 圖 5 重組質粒Bacmid-SBV-N的PCR鑒定圖（Fig. 5Identificationofthe recombinantplasmidBacmid-SBV-NbyPCR)
[0031]其中：M.DNA標準DL10000 ; 1-11.Bacmid-SBV-N用引物M13F和M13R的PCR產物； 12.Bacmid用引物M13F和M13R的PCR產物；（Μ.DNAMarkerDL1000 O; 1-11.PCRproducts ofrecombinantplasmidBacmid-SBV-NwithM13FandM13Rprimers； 12.PCRproducts ofcontrplplasmidBacmidwithM13FandM13Rprimers)；
[003引圖6重組蛋白在Sf9昆蟲細胞上表達圖（10X16) (Fig. 6Expressionof recombinatproteininSf9cell)其中：（a).正常Sf9 細胞；（b).轉染Bacmid-PPRV-N 桿粒的Sf9 細胞；（c)轉染Bacmid-GFP24h的Sf9 細胞；（d)轉染Bacmid-GFP120h的Sf9 細胞；（a).normalSf9cells;(b).Sf9cellstransfectedwithBacmid-PPRV-N;(c). Sf9cellstransfectedwithBacmid-GFPfor24h； (d).Sf9cellstransfectedwith Bacmid-GFPfor120h;
[0033] 圖 7 重組蛋白的表達鑒定圖（Fig. 7Identificationofrecombinantprotein)
[0034]其中：M.蛋白預染Marker;1.Vbacmid-SBV-N(原液）；2.V油cmid-SBV-N(原液）； 3.純化的His-SBV-N蛋白（3倍稀釋）；4.純化的MBP-SBV-N蛋白（3倍稀釋）
[0035]Μ.Marker; 1.Vbacmid-SBV-Nprotein;2.V油cmid-SBV-Nprotein;3.Purified His-SBV-Nprotein(3timesdilution) ；4.PurifiedMBP-SBV-Nprotein(3times dilution)
[0036] (a).SDS-PAGE;化）.Western-blot。
【具體實施方式】
[0037] 一種制備Vbacmid-SBV-N桿狀病毒方法，步驟如下：
[003引1)參照NCBI上公布的施馬倫貝格病毒：SBV的N基因開放閱讀框序列設計了一對 含特異性酶切位點的引物，擴增SBVN基因；
[0039] 2)將擴增的SBVN基因克隆于昆蟲桿狀病毒表達載體pFas巧a地TB;
[0040] 3)W步驟2得到的質粒轉化畑lOBac感受態細胞，得到重組穿梭質粒 Bacmid-SBV-N；
[00川 4)將步驟3得到的重組穿梭質粒Bacmid-SBV-N在脂質體介導下轉染S巧昆蟲細 胞，得到Vbacmid-SBV-N的桿狀病毒。
[0042] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的鑒定方法，步驟為，取Vbacmid-SBV-N桿狀病毒， 按1:1~1:10的比例感染Sf9昆蟲細胞，27°C培養96h~12化后，取培養的病毒上清液， 通過SDS-PAGE方法進行病毒鑒定：使用Bio-Radmini電泳儀，參照Bio-Radmini電泳儀 操作手冊說明書，對培養的病毒上清液進行SDS-PAGE電泳，同時做兩塊凝膠，一塊用于染 色分析，另一塊用于Westernblot分析。SDS-PAGE電泳后，蛋白質分子量在29. 6邸處出現 一條特征性的條帶。
[0043] 通過SDS-PAGE方法進行病毒表達特征蛋白鑒定后，再通過Westernblot方法對 病毒表達特征蛋白進行鑒定：用Bio-Rad轉膜儀將SDS-PAGE凝膠電泳的各蛋白條帶轉移至 固相載體硝酸纖維素膜上，W抗SBV核蛋白的單克隆抗體1F2 (1:1000倍稀釋）為一抗，羊 抗鼠IgG-HRP(1:3000倍稀釋）為二抗做Westernblot分析，蛋白質分子量在29. 6邸處出 現一條特征性的條帶。
[0044] -對制備Vbacmid-SBV-N桿狀病毒使用的引物，SBVF:5'-TTAGGATCCATGTCAAGCC AATTCA-3' ;SBVR:5' -ATTCTGCAGCGTTAGATGTTGATACCGA-3'。
[004引一對制備Vbacmid-SBV-N桿狀病毒使用的引物的酶切位點，SBVF的酶切位點為GGATCC;SBVR的酶切位點為CTGCAG。
[0046] -種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應用為，Vbacmid-SBV-N桿狀病毒穩定表達SBV的 核蛋白：N蛋白。
[0047] -種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應用為，Vbacmid-SBV-N桿狀病毒與抗SBVN蛋 白的單克隆抗體存在免疫學反應。
[0048] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應用為，利用Vbacmid-SBV-N桿狀病毒表達的SBV 核蛋白，作為SBV抗體檢測中酶聯免疫吸附試劑制備中的包被用抗原。
[0049] -種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應用為，利用Vbacmid-SBV-N桿狀病毒表達的SBV 核蛋白，作為SBV抗體檢測中，膠體金試紙條制備中的金標物質。
[0050] 實施例：
[0051] 1材料與方法
[0052