具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物的制備與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于有機光電材料技術領域。具體涉及一類具有線粒體靶向功能的磷光銥 配合物的制備方法及其在細胞成像、線粒體標記和氧氣傳感領域的應用領域。
【背景技術】
[0002] 線粒體是細胞內有氧呼吸作用的主要場所，線粒體中氧氣含量的變化會對呼吸作 用產生重大影響。研究表明，許多疾病都與線粒體的不正常運轉相關，如阿茲海默癥和多發 性硬化。因此研究活細胞中線粒體內氧氣濃度的變化對研究與之相關的疾病具有重大意 義。商用的熒光線粒體靶向染料，如線粒體綠色熒光探針（Mito-Track Green)，雖然具有較 好的線粒體靶向功能，但由于其對氧氣并不敏感，因此無法檢測到線粒體內氧氣濃度的變 化。
[0003] 磷光過渡金屬配合物具有優異的光電性質，并被廣泛應用于生物檢測與傳感的研 究中。與熒光探針相比，磷光過度金屬配合物具有光穩定性好、毒性低、Stokes位移大等一 系列優點。值得一提的是，磷光過渡金屬配合物的發射壽命（幾百納秒到幾十微秒）比熒 光（幾納秒）長得多，這個特性不僅賦予其對氧氣敏感的特性，還使其能夠在時間分辨成像 技術中發揮其特長，有效濾除背景熒光的干擾。
[0004] 目前關于檢測細胞中線粒體內氧氣濃度變化的探針的報道還較為少見。其設計 一般是將過渡金屬配合物與可靶向線粒體的基團結合，從而實現對線粒體中氧氣濃度變化 的檢測，如 Keyes 和 Wolfbeis 等的工作（J. Am. Chem. Soc.，2014, 136, 15300_15309、Angew· Chem. Int. Ed.，2014, 53, 12471-12475)。但這些探針的結構均較為復雜，不利于合成與制 備。因此設計合成結構更為簡單的線粒體靶向乏氧檢測探針是非常有必要的。
【發明內容】
[0005] 發明的目的：提供一類具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物的制備方法及其應 用。
[0006] 技術方案：本發明的含銥配合物的磷光材料的制備是將能夠靶向線粒體的官能團 引入到輔助配體上，使其不僅可以靶向線粒體，還能檢測細胞中線粒體內氧氣濃度的變化， 從而在細胞成像、生物標記和氧氣傳感領域具有良好的應用前景。
[0007] 本發明是一類具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物，具有如下結構式：
[0009] 具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物的合成路線如下：
[0011] 具體是化合物1與甲醇鈉和氯化銨反應，然后在乙醇鈉催化下與乙酰乙酸乙酯縮 合反應制得化合物3,再通過1，6-二溴己烷將化合物3與三苯基磷共價連接起來，從而得到 N~N輔助配體；再與銥二氯橋通過配位反應制備得到具有線粒體靶向功能的銥配合物。
[0012] 所述的具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物的應用為：活細胞線粒體的標記。
[0013] 所述的具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物的應用為：通過共聚焦成像和壽命成 像技術檢測活細胞線粒體內氧氣濃度的變化。
[0014] 所述的具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物的應用為：細胞成像、生物標記和傳 感領域。
[0015] 有益效果：本發明的磷光銥配合物具有長的發射壽命，使之不僅對氧氣敏感，還能 結合時間分辨技術區分背景熒光信號從而提高信噪比。
[0016] 本發明的磷光銥配合物能夠被可見光激發，以及具有紅光發射，從而可減弱激發 光源對生物樣品的損傷，以及具有較深的組織穿透深度。
[0017] 本發明的磷光銥配合物可應用于生物成像，線粒體標記，線粒體內氧氣濃度的傳 感，具有簡單的化學機構和良好的生物相容性，是很好的生物細胞探針。
【附圖說明】
[0018] 圖1.實施例3中銥配合物Ir-P(Ph)3W的甲苯溶液（10 5M)的紫外-可見吸收 光譜；
[0019] 圖2.實施例3中銥配合物Ir-P(Ph)3(7)的甲苯溶液（10 5M)在不同氧氣濃度下 的發射光譜；
[0020] 圖3.實施例4中銥配合物Ir-P(Ph)3(7)與商業線粒體染料的共染細胞成像；
[0021] 圖4.實施例5中銥配合物Ir-P (Ph) 3 (7)的MTT細胞毒性實驗。
[0022] 圖5.實施例6中銥配合物Ir-P (Ph)3 (7)對細胞中線粒體內氧氣濃度變化檢測的 共聚焦成像。
[0023] 圖6.實施例7中銥配合物Ir-P (Ph)3 (7)對細胞中線粒體內氧氣濃度變化檢測的 壽命成像。
【具體實施方式】
[0024] 下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實例。
[0025] 實施例1 :含三苯基磷輔助配體的制備
[0027] 化合物2的制備：化合物I (26_〇1)與甲醇鈉溶液在室溫下攪拌反應22小時 后，加入氯化銨（28_〇1)繼續反應6小時，過濾除去未反應的氯化銨，濾液旋干除去甲 醇溶劑，得到淺黃色固體粉末，然后用乙醚洗滌三次，除去未反應的化合物1，再使用乙 醇-乙醚的混合溶劑重結晶，得到白色產物化合物2。產率：83%。 1H NMR(400MHz，DMS0) δ = 9. 69 (s, 4H), 8. 85 - 8. 73 (m, 1H), 8. 45 (d, J = 8. 0Hz, 1H), 8. 14 (td, J = 7· 8, I. 7Hz，1H)，7· 85 - 7. 71(m，1H)。13C NMR(101MHz，DMS0) δ = 162. 67, 150. 33, 144. 37， 138. 76, 129. 01，124. 00。
[0029] 化合物3的制備：在乙醇鈉催化下化合物2(5mmol)與乙酰乙酸乙酯（5mmol)加 熱回流24小時后，旋干除去溶劑并將固體溶于30mL去離子水中，調節pH值至4-5,有大 量白色固體析出，過濾得該白色固體，并用乙醚和水洗滌三次，得到白色固體化合物3。產 率：56%。 1H NMR(400MHz，DMS0)S =11.89(s，lH)，8.69(d，J = 4.4Hz，lH)，8.25(d，J = 7. 9Hz, 1H), 8. 00 (td, J = 7. 8, I. 2Hz, 1H), 7. 60 (dd, J = 6. 9, 5. 1Hz, 1H), 6. 25 (s, 1H), 2. 26 ( s, 3H) 〇
[0030]
[0031]化合物 4 的制備：化合物 3(2. 50mmol)、K2C03(8. 75mmol)與 1，6-二溴 己烷（10.0 Ommol)溶于丙酮（IOmL)后在氮氣氣氛中60 °C攪拌回流過夜，反應結 束后用水和二氯甲烷萃取三次除去多余的K2CO3，收集有機相，干燥除水后旋蒸除 去有機溶劑，將得到的油狀混合物過柱子提純，得到黃色油狀液體化合物4。產 率 69 %。1H (400MHz, DMS0) δ 8.73 (ddd, J = 4. 7, 1.7, 0.8Hz, 1H), 8.34 (d, J = 7. 9Hz, 1H), 7. 96 (td, J = 7. 7, I. 8Hz, 1H), 7. 52 (ddd, J = 7. 5, 4. 7, I. 1Hz, 1H), 6. 82 (s, 1H),4. 44(t, J = 6. 6Hz, 2H), 3. 54(dd, J = 8. 6, 4. 8Hz, 2H), 2. 47 (s, 3H), L 80 (dp, J = 20. 2, 6. 7Hz, 4H), I. 46 (dd, J = 14. 4, 10. 9Hz, 4H)。
[0033] 化合物5的制備：將化合物4(0. 2mmol)和三苯基磷（2mmol)溶于N，N-二甲基甲酰 胺中，在氮氣氣氛中100°c回流72小時，反應結束后減壓旋蒸除去N，N-二甲基甲酰胺，將得 到的油狀液體過柱子提純，得到蠟狀白色凝脂化合物5。產率68%。1H NMR(400MHz，DMS0) δ 8. 70 (d, J = 4. 1Hz, 1H), 8. 32 (d, J = 7. 9Hz, 1H), 7. 94 (td, J = 7. 8, I. 7Hz, 1H), 7. 91 -7. 86 (m, 3H), 7. 82 - 7. 73 (m, 12H), 7. 50 (dd, J = 7. 0, 5. 2Hz, 1H), 6. 78 (s, 1H), 4. 40 (t, J = 6. 4Hz, 2H), 3. 56 (s, 2H), 2. 46 (s, 3H), L 75 - I. 65 (m, 2H), I. 54 (s, 4H), I. 43 (s, 2H).
[0036] 實施例2 :含三苯基磷銥配合物Ir-P (Ph) 3 (7)的制備
[0037]
[0038] 化合物Ir-P(Ph)3(7)的制備：將化合物5(0. 14mmol)和銥二氯橋（