一種借助宿主細胞的病毒包膜葉酸修飾方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于化學、病毒學、生物科學領域，具體涉及一種借助宿主細胞的病毒包膜葉酸修飾方法。
【背景技術】
[0002]包膜病毒在新型腫瘤治療基因載體開發等方面有著廣闊的應用前景。然而，由于包膜病毒不能特異性地識別腫瘤細胞，極大地限制了其應用。葉酸受體在很多腫瘤細胞表面高表達，而在正常細胞表面則表達程度很低，因此葉酸已成為一種廣譜的腫瘤細胞靶向分子。目前的病毒包膜葉酸修飾主要采用基因工程改造和化學修飾兩種方法，但基因工程改造方法耗時長、操作繁瑣、修飾配體受到限制，而化學修飾方法操作繁瑣且可能影響病毒的感染力。因此，借助宿主細胞的自然代謝及包膜病毒在細胞內的擴增實現病毒包膜的葉酸修飾是一種更優的選擇。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題在于針對現有技術的不足提供一種借助宿主細胞的病毒包膜葉酸修飾方法。
[0004]本發明將葉酸功能化磷脂加入宿主細胞培養基，利用細胞自身的代謝及細胞膜的流動性，在細胞培養過程中將葉酸功能化磷脂自然嵌入細胞膜系統。以包膜病毒感染葉酸修飾的宿主細胞，利用病毒在出芽過程中從宿主細胞膜系統上獲得包膜的過程，實現病毒包膜的葉酸修飾(如圖1所示)。
[0005]本發明方法具體包括如下步驟:
1.將葉酸功能化磷脂加入到宿主細胞培養基中，在細胞自然代謝過程中，葉酸功能化磷脂自然嵌入細胞膜系統，得到葉酸修飾的宿主細胞；
2.用包膜病毒侵染葉酸修飾的宿主細胞，病毒在出芽過程中從宿主細胞膜系統上獲得葉酸修飾的包膜，自然地實現病毒包膜的葉酸修飾；
3.細胞全部出現病變時收集細胞上清液并純化和濃縮，得到包膜修飾葉酸的病毒。
[0006]只需正常純化病毒，無需多余操作，即可得到葉酸修飾的包膜病毒。上述方法中，葉酸功能化磷脂的濃度是0.03-0.30mg/mL ;另外，可在包膜病毒的培養過程中繼續添加葉酸功能化磷脂，以加強葉酸修飾。
[0007]本發明借助細胞自身的代謝及細胞膜系統的流動性，在細胞培養過程中自然地將葉酸功能化磷脂嵌入細胞膜系統。利用包膜病毒感染葉酸修飾的宿主細胞，病毒在擴增過程中自然地從葉酸功能化的宿主細胞膜系統上獲得自身包膜，實現病毒包膜的葉酸修飾。與其它病毒包膜葉酸修飾方法相比，本發明方法借助了病毒在宿主細胞內的擴增，操作簡便、條件溫和，無需通過劇烈的化學反應或繁瑣的基因工程方法修飾病毒，最大限度地保持了包膜病毒的完整性及感染力，有利于實現病毒對非宿主細胞的靶向識別。
【附圖說明】
[0008]圖1為包膜病毒葉酸修飾的流程示意圖。
[0009]圖2為證明葉酸功能化磷脂對宿主細胞無毒的MTT圖。
[0010]圖3為證明宿主細胞被葉酸功能化磷脂修飾的免疫熒光圖，標尺為5 Mm。
[0011]圖4為證明包膜病毒葉酸修飾的免疫熒光共定位圖，標尺為5Mm。
[0012]圖5為葉酸修飾包膜病毒(a)及野生型包膜病毒(b)的透射電子顯微鏡圖，標尺為 100 nm。
[0013]圖6為葉酸修飾包膜病毒(a)及野生型包膜病毒(b)的感染力測定。
[0014]圖7為葉酸修飾桿狀病毒(a)及野生型包膜病毒(b)在葉酸受體高表達細胞表面吸附的熒光圖，標尺為10 Mm。
[0015]圖8為葉酸修飾偽狂犬病毒(a)及野生型包膜病毒(b)在葉酸受體高表達細胞表面吸附的熒光圖，標尺為10 Mm。
【具體實施方式】
[0016]通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施例僅是對本發明方法的說明，而不以任何方式限制本發明揭示的其余內容。下列實施例中未注明的具體實驗條件和方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0017][實施例1]借助宿主細胞的桿狀病毒包膜葉酸修飾
下面以桿狀病毒包膜的葉酸修飾為例，對本發明方法進行詳細的說明。
[0018]一、方法
1.宿主Sf9細胞的葉酸修飾:28° C下，將桿狀病毒宿主Sf9細胞在含有
0.03-0.30mg/mL 葉酸功能化磷脂 DSPE-PEG2000-FA (美國 NAN0CS，貨號 PG2_DSFA_2k，純度>85%)及10%胎牛血清FBS的Grace’s培養基中懸浮培養至細胞密度達約1.0X 106個/mL。
[0019]2.桿狀病毒包膜的葉酸修飾:取2 mL葉酸修飾的宿主Sf9細胞接種于細胞培養皿中，在含有0.03-0.30mg/mL葉酸功能化磷脂DSPE-PEG2000-FA及10%胎牛血清FBS的Grace’ s培養基中繼續培養至細胞密度達到約80%時，按感染復數Μ0Ι = 0.5接種桿狀病毒。
[0020]3.包膜修飾葉酸的桿狀病毒的獲得:當細胞全部出現病變時收獲上清液，6500rpm下離心15 min，上清液經0.45 Mm濾膜過濾，22300 rpm下超速離心3 h，獲得純化后的葉酸修飾桿狀病毒。
[0021]二、結果
1.葉酸修飾的宿主Sf9細胞的表征:采用MTT實驗考察了葉酸功能化磷脂DSPE-PEG2000-FA對宿主Sf9細胞的毒性(圖2)。結果表明，將宿主Sf9細胞在含有
0.03-0.30mg/mL DSPE-PEG2000-FA的細胞培養基中培養7天，未對細胞產生明顯毒性。將Dylight 488標記的葉酸抗體與宿主Sf9細胞孵育，結果如圖3所示。在含有0.03 mg/mLDSPE-PEG2000-FA的細胞培養基中獲得的宿主Sf9細胞表面即有明顯的熒光信號，表明利用葉酸功能化磷脂與宿主Sf9細胞的孵育，實現了宿主Sf9細胞表面的葉酸修飾。上述結果表明，采用MTT方法獲得的宿主Sf9細胞安全的DSPE-PEG2000-FA最低濃度0.03mg/mL,即可實現對宿主Sf9細胞的葉酸修飾。
[0022]2.桿狀病毒包膜葉酸修飾效率的表征:采用感染復數Μ0Ι = 0.5的衣殼蛋白VP39上融合表達綠色熒光蛋白GFP的桿狀病毒感染葉酸修飾的宿主Sf9細胞，獲得了子代桿狀病毒。利用GFP的綠色熒光信號與Dylight 649標記葉酸抗體的紅色免疫熒光信號的共定位表征了葉酸對病毒包膜的修飾效率(圖4)。結果表明，利用葉酸修飾的宿主Sf9細胞，獲得桿狀病毒的熒光共定位效率達到85.9 土 1.2% (N = 200)，證明借助宿主細胞膜的葉酸修飾，實現了葉酸對桿狀病毒的高效修飾。
[0023]3.葉酸修飾桿狀病毒的透射電子顯微鏡表征:米用高分辨透射電子顯微鏡(TEM)對葉酸修飾桿狀病毒及野生型桿狀病毒的結構進行了表征。如圖5所示，葉酸修飾獲得的桿狀病毒結構與野生型桿狀病毒結構無明顯差異，說明采用本發明方法對桿狀病毒進行修飾，未對病毒造成明顯的損傷。
[0024]4.葉酸修飾桿狀病毒的感染力測定:分別以感染復數Μ0Ι=0.5的葉酸修飾桿狀病毒及野生型桿狀病毒感染宿主Sf9細胞。當細胞全部出現病變時，收集細胞上清液，采用半數組織培養感染劑量(TCID50)方法測定了二者上清液的滴度(圖6)。結果表明，葉酸修飾桿狀病毒的感染力與野生型桿狀病毒的感染力基本一致，說明采用本發明方法對桿狀病毒進行葉酸修飾，能夠保持修飾病毒的感染能力。
[0025]5.葉酸修飾桿狀病毒對葉酸受體高表達細胞的識別:口腔表皮樣癌KB細胞是一種葉酸受體高表達的腫瘤細胞。分別將葉酸修飾桿狀病毒與野生型桿狀病毒加入到KB細胞中(M0I=200)，4° C吸附1 h后固定并進行熒光成像。如圖7所示，未經修飾的桿狀病毒吸附量要明顯小于葉酸修飾的桿狀病毒吸附量，說明通過對桿狀病毒的葉酸修飾，可以實現其對葉酸受體高表達的KB腫瘤細胞的特異性識別。
[0026][實施例2]借助宿主細胞的偽狂犬病毒包膜葉酸修飾
下面以偽狂犬病毒包膜的葉酸修飾為例，對本發明方法進行詳細的說明。
[0027]一、方法
1.宿主BHK21細胞的葉酸修飾:37° C下，將偽狂犬病毒宿主BHK21細胞在含有
0.03-0.30mg/mL 葉酸功能化磷脂 DSPE-PEG2000-FA (美國 NAN0CS，貨號 PG2_DSFA_2k，純度>85%)及10%胎牛血清FBS的MEM培養基中培養。
[0028]2.偽狂犬病毒包膜的葉酸修飾:在含有0.03-0.30mg/mL葉酸功能化磷脂DSPE-PEG2000-FA及10%胎牛血清FBS的MEM培養基中培養BHK21細胞至細胞密度達到約80%時，按感染復數Μ0Ι = 0.1接種偽狂犬病毒。
[0029]3.包膜修飾葉酸的偽狂犬病毒的獲得:當細胞全部出現病變時，將病變的細胞凍融兩次，收集液體，6000 rpm下離心30 min后，收集上清液并經0.45 Mm濾膜過濾，30000rpm下超速離心2.5 h，獲得純化后的葉酸修飾偽狂犬病毒。
[0030]二、結果
1.葉酸修飾偽狂犬病毒對葉酸受體高表達細胞的識別:分別將葉酸修飾偽狂犬病毒與野生型偽狂犬病毒加入到KB細胞中(M0I=200)，4° C吸附1 h后固定并進行熒光成像。如圖8所示，未經修飾的偽狂犬病毒吸附量要明顯小于葉酸修飾的偽狂犬病毒吸附量，說明通過對偽狂犬病毒的葉酸修飾，可以實現其對葉酸受體高表達的KB腫瘤細胞的特異性識別。
【主權項】
1.一種包膜病毒的葉酸修飾方法，其特征在于，用經葉酸修飾的細胞擴增包膜病毒。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述葉酸修飾的細胞為細胞膜系統葉酸化的細胞。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述包膜病毒的包膜來源于細胞膜系統。4.如權利要求1~3任一項所述的方法，其特征在于，所述經葉酸修飾的細胞是在添加有葉酸功能化磷脂的培養基中培養獲得。5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)將葉酸功能化磷脂加入到宿主細胞培養基中，用該培養基培養細胞，得到葉酸修飾的宿主細胞； (2)用包膜病毒侵染葉酸修飾的宿主細胞，病毒在出芽過程獲得葉酸修飾的包膜； (3)細胞全部出現病變時收集培養液，離心收集上清液并純化，得到純化的包膜修飾葉酸的病毒。6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，葉酸功能化磷脂的工作濃度為.0.03—0.30mg/mL。
【專利摘要】本發明涉及一種借助宿主細胞的病毒包膜葉酸修飾方法。首先將葉酸功能化磷脂加入到包膜病毒宿主細胞的培養基中，利用細胞自身的代謝及細胞膜的流動性實現宿主細胞膜系統的葉酸修飾。繼而用包膜病毒感染宿主細胞，利用病毒在宿主細胞膜系統上出芽獲得包膜的過程，自然地實現病毒包膜的葉酸修飾。本方法將葉酸功能化磷脂嵌入病毒包膜的磷脂雙分子層，因此不影響包膜病毒表面蛋白結構及其對細胞的識別功能。由于無需通過劇烈的化學反應或繁瑣的基因工程方法改造病毒，有利于保持病毒的感染力。本發明可應用于病毒對非宿主細胞的靶向識別及轉導。
【IPC分類】C12N7/00, C12N7/02
【公開號】CN105420199
【申請號】CN201511026950
【發明人】林毅, 王麗英, 文莉, 呂誠, 龐代文, 王漢中
【申請人】武漢大學
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月31日