專利名稱：：用于無抗生素ColE1質粒增殖的宿主－載體系統的制作方法
技術領域：
：本發明涉及質粒增殖領域，尤其是質粒DNA以及重組蛋白的產生。利用質粒DNA作為基因轉移工具已經廣泛用于基因治療領域。在基因治療應用中，將攜帶治療性興趣基因的質粒導入到患者中，靶細胞中該基因的短暫表達導致期望的治療效果。攜帶感興趣的治療基因的重組質粒可以通過培養細菌得到。為了篩選細菌轉化株并且為了保證質粒在細菌宿主細胞中的保持，通常地，將抗生素抗性基因包括在質粒骨架中。質粒的篩選通過將細胞在包含各自抗生素的培養基中生長而實現，其中只有攜帶質粒的細胞能夠生長。利用抗生素抗性基因進行篩選質粒以用于基因治療具有以下缺點由于在基因治療中，完整的質粒被遞送，抗生素抗性基因導入到治療對象中。盡管這些基因被原核啟動子所啟動并且因此在哺乳動物細胞以及組織中沒有活性，存在將遞送的基因整合到細胞基因組中的可能性并且因此可能，如果在哺乳動物啟動子附近，可能被轉錄并且表達。攜帶抗生素抗性基因的質粒第二個缺點是可能被帶有殘留的抗生素最終的產物污染。考慮到可能的免疫致敏性，這是一個問題，尤其是利用β-內酰胺抗生素的情形下。為了避免這些風險，在禁止將抗生素抗性基因用于制備治療性質粒方面以及開發代替性的篩選方法方面已經進行了不懈的努力。在嘗試實現無抗生素篩選方面，已經使用了能夠補償宿主營養缺陷型的質粒。但是，該方法以及所有相關方法的主要的缺點在于需要在質粒插入另外的基因(例如Hgg等，2004)。另外一種方法是稱為“阻抑蛋白滴定”的思想(Wiliams等，1998)。根據該思想，包含kan基因(卡那霉素抗性基因)修飾的大腸桿菌宿主株在lac操縱子/啟動子控制下。在缺失誘導劑(IPTG或者異乳糖)的情形下，該株不能在包含卡那霉素的培養基中生長。用包含lac操縱子的高拷貝數目的質粒轉化導致kan表達，通過從操縱子滴定lacI。在加入卡那霉素之后，只有包含高質粒拷貝數的細胞能夠生存。該思想的主要缺點再次地在于使用抗生素不可缺少。本發明的目的在于提供一種不用抗生素的新穎的質粒篩選體系。為了解決本發明的問題，已經開發了通過使用帶有ColE1復制起點的質粒的復制機制(在下文中，帶有ColE1復制起點的質粒稱為“ColE1-型質粒”)。大量天然存在的質粒以及許多最常用的克隆工具是ColE1-型質粒。這些質粒復制其DNA，利用涉及合成兩種RNA分子的常規的機制，這些分子一方面相互作用并且另一方面與模板質粒DNA相互作用(Helinski，1996；Kues和Stahl，1989)。代表性的ColE1-型質粒是天然存在的ColE1質粒pMB1、p15A、pJHCMW1，以及常用的以及商業提供的克隆工具如pBR322以及相關的載體，pUC質粒、pET質粒以及pBluescript載體(例如Bhagwat和Person，1981；Balbas等，1988；Bolivar，1979；Vieira和Messing，1982)。對于所有這些質粒，復制的ColE1啟動以及復制的調節已經進行了廣泛的描述(例如Tomizawa，1981，1984，1986，1989，1990；Chan等，1985；Eguchi等，1991a；Cesareni等，1991)。ColE1區包含針對參與復制的調節的兩種RNAs的兩種啟動子。從ColE1-型質粒的復制起始自預引物RNAII(復制起點上游555bp)的轉錄，通過宿主的RNA聚合酶。在延伸的過程中，RNAII折疊成特定的發夾結構，并且約550個核苷酸的聚合之后，開始與模板DNA形成雜合體。隨后，RNAII預引物被RNaseH裂解以形成具有游離的3’OH末端的活性引物，其可以被DNA聚合酶I接近(Lin-Chao和Cohen，1991；Merlin和Polisky，1995)。在ColE1-型起始鏈的相對側，RNAI，108個核苷酸的反義RNA，互補于RNAII的5’端，也被轉錄。RNAI的轉錄起始自復制起點上游的445bp處，直至約RNAII轉錄開始的地方。在RNA/DNA雜合體形成之前通過結合至延伸的RNAII分子，RNAI抑制引物的形成以及由此的復制。兩種RNAs之間的相互作用是一個逐步過程，其中RNAI和RNAII形成數種莖環結構。它們初始通過它們互補環之間的堿基配對以形成所謂的“相吻復合物”而相互作用。隨后，RNAI沿著RNAII雜交，并且形成穩定的雙鏈體。相吻復合物的形成對復制的抑制至關重要。由于其是限速步驟，其已經進行了深入的研究(Gregorian和Crothers，1995)。除了RNAI/RNAII相互作用，ColE1的rom/rop的轉錄也促進質粒拷貝數目的控制，通過增加在RNAII和RNAI之間的復合物形成速率。為了增加拷貝數目，在一些pBR322衍生物中，編碼rom/rop的基因已經被刪除，例如在pUC19上。本發明第一方面涉及一種非天然存在的細菌細胞，包含，i)編碼表達可被調節的蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列可操作地連接至下述序列，ii)DNA序列，編碼模擬RNAII序列或者其部分的RNA序列，所述的RNA序列互補于可從帶有ColE1復制起點的質粒轉錄的RNAI序列。在其他的方面，本發明涉及一種宿主-載體系統，包括帶有ColE1復制起點的質粒以及其中所述的質粒能夠被復制的細菌宿主細胞，其中所述的宿主-載體系統包括a)帶有ColE1復制起點的質粒；b)細菌宿主細胞，其中所述的質粒能夠被復制，包含i)編碼表達可被調節的蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列可操作地連接至下述序列，ii)DNA序列，編碼模擬RNAII序列或者其部分的RNA序列，所述的RNA序列互補于可從質粒a)轉錄的RNAI序列；其中在ii)中定義的所述的RNA序列，在不存在質粒a)的情形下，容許所述的蛋白的表達以及其中，當所述的質粒a)存在于所述的宿主細胞b)中的時候，從質粒轉錄的RNAI分子與在ii)中定義的所述的RNA序列雜交，從而所述的蛋白的表達被抑制。在優選的實施方案中，DNA序列i)為外源的DNA序列。在優選的實施方案中，被所述的外源的DNAi)編碼的蛋白對宿主細胞而言是有毒的或者致死的。在進一步的方面，本發明涉及宿主-載體系統，包括帶有ColE1復制起點的質粒以及其中所述的質粒能夠被復制的細菌宿主細胞，其中所述的宿主-載體系統包括a)帶有ColE1復制起點的質粒；b)非天然存在的細菌宿主細胞包含，整合到其基因組中的，i)編碼蛋白的外源的DNA序列，所述的蛋白對所述的宿主細胞是致死的或者有毒的，所述的DNA可操作地連接至下述序列，ii)DNA序列，編碼模擬RNAII序列或者其部分的RNA序列，所述的RNA序列互補于可從質粒a)轉錄的RNAI序列；并且其中在所述的ii)中定義的RNA序列在缺失質粒a)的情形下，容許所述的致死的或者有毒的蛋白的表達以使所述的宿主細胞的生長被全部或者部分地抑制，并且其中，當所述的質粒a)存在于所述的宿主細胞中，從質粒轉錄的RNAI分子與在ii)中定義的所述的RNA序列雜交，從而所述的致死的或者有毒的蛋白的表達被抑制，從而帶有質粒細胞的完全或者部分的生長抑制被取消。本發明利用基于ColE1-型質粒的RNA-拷貝數目的控制機制，用于調節存在于細菌宿主細胞中的一種或者多種基因的表達，優選地插入在細菌基因組中，并且充當篩選標志物。在下文中，i)的DNA序列(或者從如此的DNA轉錄的RNA分別地)稱為“標志物基因”(或者“標志物RNA”，分別地)。如上所述，在本發明的實施方案中，標志物基因編碼本身是致死的或者有毒的蛋白。在該實施方案中，在本發明的上下文中，術語“標志物基因”也包含其表達產生有毒作用的基因，所述的有毒作用不是直接地由于表達產物，而是基于其他的機制，例如一旦表達標志物基因就產生有毒的物質。簡單而言，在下文中，被標志物基因編碼的蛋白稱為“標志物蛋白”；在標志物蛋白是致死的或者有毒的蛋白的情形下，其稱為“有毒的蛋白”。在優選的實施方案中，標志物蛋白本身不是致死的或者有毒的或者由于一旦其表達產生有毒的作用，而是通過阻抑對所述的細菌細胞的生長必需的基因的轉錄。這些標志物蛋白，或者其編碼DNA，分別地稱為“阻抑蛋白”或者“阻抑蛋白基因”，并且對所述的細菌細胞的生長必需的基因稱為“必需基因”。在下文中，模擬RNAII序列的RNA序列，或者其部分，稱為“RNAII-樣序列”。在本發明的上下文中，″可操作地連接″指DNA序列i)以及DNA序列ii)以如下的方式相互放置以使被所述的DNA序列i)編碼的標志物蛋白的表達被所述的RNA序列ii)(RNAII-樣序列)調節。本發明的原理，即，RNAI-介導的標志物基因下-調或者沉默，顯示在圖1中RNAII-樣序列以及ShineDalgarno序列存在于宿主的轉錄物上。從質粒轉錄的RNAI序列充當所述的RNAII-樣序列的反義RNA并且因此抑制標志物mRNA的翻譯。在標志物基因表達的誘導之后，在標志物基因編碼有毒的蛋白的情形下，宿主只有在質粒存在的情形下才能夠生存，因為質粒提供了RNAI序列，其與RNAII-樣序列互補并因此與標志物基因轉錄物雜交，從而防止有毒的蛋白的翻譯。如上描述，系統的調節基于質粒的RNAI以及與其互補的確定長度的RNAII-樣序列之間的RNA-RNA相互作用，RNAII-樣序列位于標志物基因序列(通常位于宿主的mRNA中)核糖體結合位點的上游或者下游。RNAII-樣序列的長度以及相對于核糖體結合位點以及相對于標志物基因的起始密碼子的距離以及位置必須保證無質粒的宿主能夠翻譯mRNA；意味著必須小心地確保RNAII-樣序列不干擾核糖體結合以及翻譯。同樣地，插入的RNAII-樣序列必須進行適當的設計以及放置以使其保證互補序列之間的足夠的RNA-RNA相互作用，從而當存在質粒的時候，從其轉錄的RNAI結合至宿主mRNA，結合程度足以抑制標志物基因的翻譯。標志物基因的抑制達到一定的程度以使提供優勢生長，與無質粒從而也不存在RNAI的細胞相比。因此，細菌宿主進行改造以使在不存在ColE1-型質粒的情形下，標志物mRNA翻譯成標志物蛋白，并且在存在ColE1-型質粒的情形下，蛋白的翻譯被全部地或者部分地抑制。在所述的mRNA編碼部分或者全部地抑制細胞生長的有毒的蛋白地情形下，包含該質粒地宿主將在毒性物質存在下生存或者生長超過無質粒的宿主。對于本發明的目的，有毒的蛋白在其部分地或者全部地抑制細胞的生長的角度而言是有毒的，抑制至少至如下的程度以使沒有標志物基因的細胞具有相對優勢的生長率。如果存在兩個細胞群，一方面為具有標志物基因的群并且，另外一方面，沒有或者帶有受抑制的標志物基因的群，以等摩爾的分布，沒有或者帶有受抑制的標志物基因的細胞群在少于10代以內將增加至占群的99％。在本發明的實施方案中，標志物基因的表達被另外的機制調節，例如通過誘導。由于在標志物基因編碼有毒的蛋白的情形下，標志物基因在細胞增殖期間需要關閉，可誘導的啟動子有利地用于轉錄控制，其只有在加入誘導劑的情形下才促進mRNA轉錄。實例為產生T7-聚合酶的宿主中的T7啟動子，因為是T7-聚合酶在IPTG的控制下，或者乳糖-可誘導的Lac-啟動子或者阿拉伯糖-可誘導的啟動子。或者，所述的標志物基因編碼本身不是有毒的蛋白，但是通過非直接機制的發揮作用，例如酶，其在加入底物之后，將底物修飾為有毒的物質。實例為源自Bacillussubtilis的SacB。sacB編碼稱為果聚糖蔗糖酶的蛋白。該蛋白將蔗糖轉化為果聚糖，一種對細菌有毒的物質。ColE1-型質粒的RNAI序列代表了貢獻該系統的優勢的必要的特征。它提供了攜帶質粒宿主的篩選標準，無需借助于質粒上的其他的篩選標志物，例如抗生素抗性基因。因此，本發明提供了一種用于ColE1-型質粒的無抗生素篩選的革新系統。在本發明的實施方案中，下述成分是有用的1.宿主細胞由于其復制依賴于宿主細胞器，ColE1-型質粒是具有窄宿主范圍的質粒。復制局限于大腸桿菌以及相關的細菌如Salmonella以及Klebsiella(Kues和Stahl，1989)。因此，宿主唯一必須的性質在于其具有復制ColE1質粒的能力。合適的宿主為廣泛使用的大腸桿菌株K12或者B株或者相關的商業提供的株，例如JM108、TG1、DH5alpha、NovaBlue、XL1Blue、HMS174或者L121(評述參見Casali，2003)。優選的宿主細胞的遺傳特征是突變，可以改善質粒穩定性以及完整重組蛋白的質量或者回收。期望的遺傳特性的實例為recA(缺失同源重組)、endA(缺失核酸內切酶I活性，其改善質粒微制備的質量)或者ompT(缺失外膜蛋白酶)，hsdr(廢除一些序列的限制性但是甲基化除外)，hsdS(廢除一些序列的限制性以及甲基化)。在本發明的實驗中，使用宿主株HMS174(DE3)(Novagen)，其包含DE3噬菌體，帶有在其基因組中的IPTG可誘導的T7聚合酶(Studier和Moffatt，1986)。合適宿主的另外一個實例為HMS174(DE)pLysS，其另外地包含pACYC184質粒(CmR)，其帶有可以降低非誘導狀態下的T7-啟動子轉錄活性的T7-溶菌酶的基因。特別地，在致死的標志物蛋白的情形下，期望在沒有誘導下避免其表達。2.用于改造宿主細胞的構建體適合用于改造宿主細胞的構建體的原理顯示在圖2中所有的成分-兩個同源區臂[H]，啟動子+操縱子[P+O]，RNAI標志物序列(RNAII-樣序列)，具有轉錄終止子以及Kan盒(卡那霉素抗性盒包含FRT，+/-FLP重組酶識別標志物序列；或者，可以使用其他的常規篩選標志物)的標志物基因[基因](在實施例中，GFP用于初始的實驗中)，克隆到合適的載體的多克隆位點，例如pBluescriptKS+。用于基因組插入的線性片段利用限制酶切或者利用PCR擴增。卡那霉素抗性盒能夠利用例如從pUC4K載體(Invitrogen)得到。其可以通過兩個不同的位點克隆到片段中，即標志物基因之前或者之后。為了避免在有意地開啟之前非有意的標志物基因的不成熟轉錄，該基因優選地插入在染色體基因的相反方向。優選地，標志物構建體整合到細菌基因組中。這可以利用常規的方法實現，例如通過利用包含與染色體上中性位點同源的側面序列的線性片段，例如與attTN7-位點同源(Rogers等，1986；Waddel和Craig，1988；Craig，1989)或者與recA位點同源。片段轉化到宿主中，例如包含質粒pKD46的的大腸桿菌株MG1655或者HMS174(Datsenko盒Wanner；2000)。該質粒攜帶λRed功能(γ，β，exo)，可以促進體內重組。或者，可以使用DY378(Yu等，2000)，攜帶缺失的λ原噬菌體的大腸桿菌K12株。在MG1655或者DY378的情形下，包括表達片段的染色體位點能夠導入到HMS174(DE3)基因組中，通過利用P1噬菌體的轉導。陽性克隆篩選抗生素抗性，例如在利用針對卡那霉素或者氯霉素的Kan盒的情形。抗性基因可以隨后利用FLP重組酶功能去除，基于酵母2小質粒的位點特異性重組系統、FLP重組酶及其重組靶位點FRTs(Datsenko和Wanner，2000)。或者為了將構建體整合到宿主基因組中，其可以存在于噬菌體或者不同于ColE1-型質粒的質粒上，并且從其不影響標志物基因(以及感興趣的基因)的表達的角度講其與本發明的系統相容。可以用于本發明實驗的合適的質粒或者噬菌體的實例為pACYC184(其為miniplasmidp15A的衍生物；參見Chang和Cohen，1978)，R1-miniplasmid(Diaz和Staudenbauer，1982)，基于F1的質粒或者絲狀噬菌體(Lin，1984)或者質粒pMMB67EH(Fürste等，1986)。更具體地，合適的構建體的元件能夠定義如下2.1.同源臂在本發明的初始實驗中已經發現，在構建體的每一側的30bp同源區對由λRed系統介導的重組而言是足夠的(Yu，2000)。但是，由于利用更長的同源區得到更好的結果，臂優選地為50-400bp。在實施例中，使用250以及350bp同源區臂。2.2.啟動子如果外源的標志物基因產物本身對細胞有毒的或者致死的或者如果其為阻抑蛋白，其表達必須進行調節。啟動子區域必須包含合適的操縱子序列(例如Lac操縱子)以控制基因的表達。根據本發明的一些實施方案，使用T7啟動子，tac或者，trc啟動子，lac或者lacUV5啟動子，pBAD啟動子(Guzman等，1995)，trp啟動子(被色氨酸抑制)，P1啟動子(以及ci阻抑蛋白)或者gal啟動子。當使用lac操縱子的時候，加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷，一種人造的Lac操縱子誘導劑)或者乳糖用來活化標志物基因。當使用可誘導的系統的時候，在不誘導的時候細菌能夠生存，但是一旦加入誘導劑就死亡。為了實現有毒的基因表達的緊密調節，優選地使用緊密調節的啟動子如阿拉伯糖-可誘導的PBAD啟動子(Guzman等，1995)，尤其在標志物蛋白本身對細胞有毒的情形下。另外一種控制標志物基因表達的方式是使用組成性啟動子結合無-毒的基因(例如報告基因)或者只有在一定的條件下才有毒的基因，例如BacillussubtilissacB基因。當蔗糖存在的時候，SacB才對大腸桿菌有毒的。選擇啟動子以與下列因素相協調標志物基因產物的作用以及需要的RNAI的下調或者沉默作用的效率。例如，對于包含無毒的或者較小毒性的標志物基因的構建體，需要更強的啟動子。2.3.RNAII-樣序列由于RNAI必須充當部分的或者完全的抑制劑，與RNAI(10-555nt)互補的RNAII-樣序列必須位于標志物基因的上游，以及位于所述的RNAII-樣序列上游、下游或者中的核糖體結合位點(Shine-Dalgarno序列)。Shine-Dalgarno序列(SD)指位于原核mRNA分子的翻譯起始位點的上游的短的核苷酸片段，并且充當結合核糖體RNA并且因此將核糖體帶到mRNA上的啟動密碼子處。當位于RNAII-樣序列的上游的時候，SD序列，優選地由7個核苷酸組成(GAAGGAG)應該位于標志物基因ATG起始密碼子上游約4至15bp，例如7bp處。在核糖體結合位點位于與標志物基因互補的RNAI序列中的時候，該序列插入的方式應該使只有莖區域改變，環結構以及優選地整個二級結構應該保持不變以使反義RNA與RNAI相互作用并形成相吻復合物。在RNAII-樣序列之前提供起始密碼子的實施方案中，構建體得到融合的產物，包括標志物序列以及RNAII-樣序列。在另外一個實施方案中，RNAII-樣序列插入到核糖體結合位點以及起始密碼子之間；該方法限于翻譯容許的可能的最大缺口，例如15至20bp(如果核糖體結合位點和起始密碼子之間的距離增加，翻譯效率下降)。或者直接融合RNAII-樣序列以及標志物基因，RNAII-樣序列可以翻譯地偶聯標志物基因。為了實現這種目標，例如，可以使用如此的構建體起始自起始的ATG，接著是RNAII-樣序列，進一步地為核糖體結合位點，代表在終止以及起始密碼子之間重疊的序列，例如TGATG，以及標志物序列。在這種情形下，只有當RNAII-樣序列已經翻譯并且與標志物基因相分離的時候，標志物基因才翻譯。這種設計的優點在于與標志物基因的蛋白融合不是必須的。該方法提供了分開的翻譯的選擇，這對一些標志物蛋白可能是有利的，例如在一些阻抑蛋白如Tet阻抑蛋白的情形下。由于甚至是單個的RNAI/RNAII莖環形成相吻復合物(Eguchi1991b；Gregorian，1995)，必須確保至少形成單一環。在任何情形下，必須滿足兩個必要條件，即，一方面，標志物mRNA的翻譯而不管插入的環結構，以及另外一方面，在RNAII-樣序列的插入的環結構以及質粒上的互補的RNAI之間有效的RNA-RNA反義反應。在RNAI以及包含RNAII-樣序列的標志物mRNA之間的相互作用具有抑制結合核糖體的目的，從而廢止翻譯。所述的mRNA在可誘導的啟動子(例如lac，阿拉伯糖或者T7啟動子)控制之下，并且在誘導(例如利用IPTG、乳糖、阿拉伯糖)之后，所述的標志物基因的表達下調，只要從質粒復制起點產生足夠的RNAI。優選地，標志物基因編碼致死的蛋白或者有毒的蛋白，以抑制細胞生長至少至一定的程度(如上定義)；在這種情形下，表達導致細胞死亡或者下降的細胞生長(無質粒細胞)，而下調提供了細胞-生長(攜帶質粒細胞)。或者對于編碼致死的或者有毒的蛋白的標志物基因，標志物基因可以編碼任何蛋白，無論出于任何目的其表達在細菌細胞生長期間被調節。特別地，標志物基因可以為報告基因，如下描述(2.4.)。在本發明的系統中，RNAI，其通常地負責質粒復制的下調，充當“基因-沉默劑”，盡管復制的抑制下降了。因此，利用本發明的系統導致質粒復制的增加，這對細菌宿主細胞的生存是有利的。2.4.標志物基因RNAI-介導的標志物基因的下調，其為本發明的關鍵特征，可以適用于出于任何目的表達需要調節的任何基因。根據第一方面，RNAI-介導的下調可以用于對宿主是有條件地致死的標志物基因(例如評述參見Davison，2002)。本身有毒的并且適于用于本發明的標志物基因的實例是編碼限制性核酸酶的基因(例如CviAII，源自Chlorella病毒PBCV-1的限制性核酸內切酶；Zhang等，1992)，EcoRI(Torres等，2000)，編碼與蛋白相互作用的毒素的基因，例如鏈親和素或者Stv13(截短的易溶的鏈親和素變體)，如由Szafransky等，1997；Kaplan等，1999；Sano等，1995等描述，其通過剝奪細胞生長必須的蛋白生物素而發揮作用)；編碼破壞膜的蛋白的基因(ΦX174的E基因蛋白(Ronchel等，1998；Haidinger等，2002)，gef(Jensen等，1993；Klemm等，1995)，relF(Knudsen等，1995)；編碼其他細菌毒素的基因，例如源自誘捕DNA促旋酶的F-質粒編碼強效的細胞殺死蛋白的ccdb基因(Bernard和Couturier，1992)或者源自BacillusSubtilis的sacB(Gay等，1983)；或者編碼對細菌宿主有毒的真核毒素的基因(例如FUS；Crozat等，1993)。當使用有毒的基因的時候，必須的是其表達能夠被可誘導的啟動子調節。沒有誘導劑的時候，該啟動子必須沒有活性，但是一旦誘導提供表達，足以抑制細胞生長。其他的對細菌有毒的并且可以用于本發明的基因實例由Rawlings，1999中給出。在一些實施方案中，標志物基因選自編碼限制性核酸酶、鏈親和素的基因或者具有間接有毒的作用的基因，例如如上描述的SacB。在優選的實施方案中，有毒的標志物蛋白本身不是致死的或者有毒的或者一旦其表達存在有毒的作用，而是通過阻抑對所述的細菌細胞生長必須的基因的轉錄而發揮作用的阻抑蛋白。在本發明的該實施方案中，在質粒存在下的RNAI-介導的下調影響阻抑蛋白。這意味著存在RNAI及其與阻抑蛋白mRNA(RNAII-樣序列)的相互作用導致抑制阻抑蛋白并且因此活化或者上調必需基因，作用在于細胞的生長只有在存在復制的質粒條件下才發生。在該實施方案中，必需基因的啟動子通過提供結合的DNA序列(“操縱子”)而修飾，優選地天然的啟動子被完全的、可誘導的啟動子(包含操縱子序列)所替換，以使表達的阻抑蛋白蛋白，例如Tet阻抑蛋白，能夠結合至操縱子，從而抑制必需基因的轉錄并且調節其表達，例如murA(通過Tet阻抑蛋白的表達)。操縱子為結合其特異性阻抑蛋白或者增強子的DNA序列，從而鄰近的基因的轉錄被調節，例如位于lac啟動子中的lac操縱子，具有序列TGGAATTGTGAGCGGATAACAATT(SEQIDNO53；Gilbert和Maxam，1973)或者其衍生物(Bahl等，1977)。不應該存在于野生-型的宿主中的阻抑蛋白基因，改造到基因組中，該基因組在可誘導的啟動子的控制下，例如T7，lac或者tac啟動子。在正常的生長條件下，阻抑蛋白不表達。誘導之后，通過例如IPTG，阻抑蛋白表達，結合到必需基因的啟動子區中的人工導入的操縱子或者人工插入的啟動子并且因此抑制各個必需基因的表達。只要在宿主中存在復制的ColE1質粒，就產生能夠結合阻抑蛋白mRNA的RNAI，從而阻抑蛋白mRNA被相應地改變。通過這種RNA-RNA相互作用，阻抑蛋白的翻譯被抑制(類似地對任何其他的有毒的標志物蛋白)。從而，產生必需基因產物并且細胞保持活力并且生長。本質上，在該實施方案中，細菌宿主包括，除了RNAII-樣序列以外，在可誘導的啟動子(其已經被改造到基因組中以修飾或者，優選地全部地替代必需基因的天然存在的啟動子)控制下的其必需基因之一(作為天然存在于細菌基因組中)。控制必需基因的啟動子區域還包含被所述的阻抑蛋白識別以及特異性地結合的DNA序列(操縱子)。該阻抑蛋白基因，其已經改造到細菌染色體中，也在不同于控制必需基因的啟動子的可誘導的啟動子的控制之下，因此這兩種啟動子是獨立地可誘導的。必須的細菌基因在文獻中是公知的，例如Gerdes等，2002以及2003，以及PEC(ProfilingtheE.Coli.Chromosome)數據庫(http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/pec/genes.jsp)，例如Isoleucyl-tRNA合酶(ileS)，細胞分裂蛋白如ftsQ、ftsA、ftsZ、DNA聚合酶IIIα亞基(dnaE)、murA、map、rpsA(30s核糖體蛋白S1)、rpsB(30s核糖體蛋白S2)、lytB(全局調節子)等。阻抑蛋白是結合至操縱子位于操縱子中的啟動子的蛋白，從而下調位于所述的操縱子中的基因的轉錄。適合用于本發明的阻抑蛋白的實例為四環素阻抑蛋白(tet)蛋白TetR，其調節革蘭(氏)陰性的細菌中的四環素抗性決定簇家族的轉錄，并結合至四環素(Beck，等，1982；Postle等，1984)，色氨酸阻抑蛋白(trp)，其結合至trp操縱子的操縱子，trp操縱子包含色氨酸生物合成基因(Yanofski等，1987)。可誘導的啟動子的實例為啟動子，其中在加入物質之后開始轉錄，因此能夠被環境因素調節，例如lac啟動子，其可通過IPTG誘導(Jacob和Monod，1961)，阿拉伯糖-啟動子(pBAD)、可被阿拉伯糖誘導(Guzman等，1995)，以及銅-可誘導的啟動子(Rouch和Brown，1997)。在本發明的實驗中，選擇tet-阻抑蛋白(tetR)作為阻抑蛋白基因，充當“有毒的”標志物基因，一旦加入誘導劑IPTG就關閉必須的細菌基因。為了執行阻抑蛋白基因方法，涉及了兩種類型的盒并在本發明的實驗中(實施例4)插入到細菌染色體中。第一種構建體包括用來替換(或者修飾)基因組上特定的必需基因的啟動子的盒。第二種類型的盒用作測試構建體，使用GFP作為必需基因的替代物以提供思想的證據。使用GFP測試構建體的實驗目的在于評價級聯調節系統、啟動子強度以及因此對系統中所有相互作用成分的調節。因此，在另一個實施方案中，標志物基因是報告基因，例如編碼GFP(綠色熒光蛋白)、hSOD(人超氧化物岐化酶)、CAT(氯霉素乙酰轉移酶)或者螢光素酶。當需要有關宿主細胞中存在或者缺失ColE1-型質粒或者質粒拷貝數的信息的時候報告基因可用于培養過程。當發酵過程需要對質粒拷貝數的控制進行優化的時候，這些信息特別有用。報告基因也可以充當有毒的標志物基因的替代物，并且可以因此可以用于實驗，該實驗的目的在于提供構建體的如下功能用于基因調節或者沉默以及確定其對有毒的標志物基因的作用。為了評價設計用來改造細菌宿主以使有毒的標志物基因的表達能夠被ColE1-型質粒調節的構建體的功能，報告基因，綠色熒光蛋白“(GFP)用作本發明初始實驗中的模型。由于其自發熒光(Tsien，1998)，被認為在初始實驗中，GFP適合用來分別地代替標志物基因，或者必需基因。在一些本發明的實施方案中，標志物基因可以為內源性的宿主基因，其可以為任何意欲調節的感興趣的基因。在這種情形下改造宿主細胞以使編碼RNAII-樣序列的序列與相關的宿主基因可操作地連接，如2.3中所述。3.ColE1-型質粒在本發明中，所有的ColE1-型質粒及其天然的RNAI/RNAII對，以及修飾的RNAI和/或RNAII序列，例如在WO02/29067中描述的那些，可以使用。如上所述，代表性的可用的ColE1-型質粒為天然存在的ColE1質粒pMB1、p15A、pJHCMW1，以及常用的以及商業提供的克隆工具如pBR322以及相關的載體，pUC質粒，pET質粒以及pBluescript載體。在質粒序列中不需要包括抗生素抗性基因。作為必須的元件，質粒基本上只包含ColE1復制起點以及攜帶感興趣基因的基因表達盒。質粒上的感興趣的基因及其啟動子取決于應用的類型；本發明不以任何方式限制于感興趣的基因，例如治療性基因。對于基因治療應用，基因可以與真核啟動子可操作地連接，例如CMV啟動子。本發明的應用本發明能夠廣泛地用于現代發酵中，包括用于質粒DNA制備以及用于制備重組蛋白二者。已經描述了可以用于本發明的發酵pDNA的數種方法。質粒DNA制備的方法在施加到細胞上的控制水平以及影響發酵的多種因素方面不同對于實驗室水平的pDNA制備，在搖瓶種培養攜帶質粒細胞是最簡單的方法(O′Kennedy等，2003；Reinikainen等，1988；O′Kennedy等，2000；US6,255,099)。為了得到更高數量的質粒，細胞能夠在稱為“批發酵″的受控發酵桶中進行培養，其中在起始的時候提供所有的營養成分并且其中在培養的過程中不加入營養成分。這種類型的培養可以利用包含所謂的“復合物成分”的培養基作為碳以及氮源進行，如例如由O′Kennedy等，2003，以及Lahijani等，1996，以及在WO96/40905，US5,487,986核WO02/064752中記載。或者，合成的培養基可以用于pDNA產生，例如特定用于pDNA產生的確定的培養基(Wang等，2001；WO02/064752)。本發明也可以用于大腸桿菌的補料分批發酵，其中一或者多種營養成分通過補料提供給培養物，通常地通過利用反饋控制算法通過補料營養成分以將過程參數控制在確定的設定點。在發酵過程中，反饋控制因此直接與細胞活性相關。可以用于發酵的反饋控制的控制參數包括pH值，在線測定的細胞密度或者溶解的氧張力(DOT)。通過補料速率用于將溶解的氧張力控制在確定的設定點的反饋算法記載在WO99/61633中。另外，更復雜的算法利用DOT以及pH值二者作為用于反饋培養方法的控制參數(US5,955,323；Chen等，1997)。另外一種補料模式基于按照指數函數的補料培養基提供。補料速率基于期望的特定的生長速率μ進行控制。WO96/40905以及O′Kennedy等，2003描述了用于質粒DNA制備的指數補料分批方法。Lahijani等，1996，描述了聯合指數補料以及溫度可控制的質粒復制增加。或者，本發明可以用于制備質粒DNA的方法，其中大腸桿菌細胞首先在預先培養基中生長并且隨后在主培養物中發酵，主培養為補料分批方法包括分批階段以及補料階段。分批階段的培養基以及在補料階段加入的培養基是化學確定的，并且補料階段的培養基包含生長-限制性底物并且補料加入的速率符合預定的指數函數，從而將特定的生長速率控制在預定值。當標志物基因在可誘導的啟動子的控制下的時候，在開始的時候和/或脈沖的方式可以將誘導劑加入到批中(在批以及在補料分批培養二者中)。在補料階段，誘導劑可以脈沖的方式或者連續地加入。在發酵過程結束的時候，將細胞富集并分離質粒DNA并且根據本領域公知的方法進行純化，例如利用基于陰離子交換的以及凝膠滲透層析的方法，如在US5,981,735中記載，或者通過利用兩個層析步驟，即，陰離子交換層析作為第一步驟并且反相層析作為第二步驟，如在US6,197,553中所描述。制備質粒DNA的另一個合適的方法記載在WO03/051483中，其利用兩個不同的層析步驟，結合monolithic支持。除了將本發明用于質粒制備以外，例如用于制備用于基因治療應用的質粒，也可以用于重組蛋白制備。關于重組蛋白制備，原則上，可以使用已經被證明可以用于表達大腸桿菌中感興趣基因的任何方法，尤其是源自ColE1型質粒(參見評述，例如Jonasson等，2002；Balbas，2001)。蛋白可以在細胞內(全部地或者部分地可溶或者作為包涵體)或者通過分泌(到細胞培養基或者壁膜間隙)的方式得到，從批發酵或者，優選地補料分批培養，利用復合的、合成的或者半合成的培養基。在質粒DNA制備中，通常用于基因治療的質粒DNA，感興趣的基因不在細菌宿主細胞中表達。考慮到其在哺乳動物優選地人中的應用，其中其必須最終地表達，感興趣的基因通常與真核啟動子可操作地連接。與此對應的是，對于在大腸桿菌中的重組蛋白的制備，感興趣的基因的將在原核啟動子的控制在宿主細胞中表達。對于重組蛋白的制備，兩種啟動子，即控制標志物基因的啟動子以及感興趣基因的啟動子，可以相同或者不同，只要不發生擾亂其中任何一種表達的干擾。有利地，由于其活性在時間點以及轉錄水平上相互獨立，啟動子是不同地被調節。優選地，控制標志物基因地啟動子在發酵過程開始的時候具有活性并且產生適度量的mRNA，同時感興趣基因的啟動子是相當強的并且在發酵過程中的選擇的時間點激活。如果對感興趣的基因以及標志物基因二者都使用可誘導的啟動子，通常選擇以使利用不同的誘導劑開啟它們。或者，標志物基因可以在可誘導的控制之下并且感興趣的基因在組成性啟動子的控制之下，或者反之亦然。這對下述兩種方法都適用其中標志物基因構建體整合到細菌宿主基因組中，以及其中標志物基因構建體包含在質粒或者噬菌體中，如上描述。關于啟動子在發酵各階段的誘導，針對質粒DNA制備的上述原理也適用。本發明的巨大優勢在于所有復制的質粒無抗生素抗性基因并且因此，除了用于基因治療應用以外，適合用于其中缺失抗生素抗性基因是需要的或者期望的所有的應用，例如用于產生將用于人體以及動物食物制備的重組酵母株或者用于產生重組植物。附圖簡述圖1RNAI-介導的標志物基因下調或者沉默的原理圖2用于改造宿主細胞的構建體圖3利用體內轉錄的構建體雜交實驗的結果圖4包含標志物基因和RNAII-樣序列的構建體圖5存在pBR322的條件下的基因下調作用圖6多種質粒的基因下調作用圖7在發酵期間標志物基因的表達/抑制圖8基于包括必需基因啟動子替換的必需基因的構建體的原理圖9用于阻抑作為必需基因替代物的GFP的測試構建體。圖10利用插入到HMS174(DE3)基因組中的測試構建體的搖瓶實驗結果在實施例1和2中，使用在表1中顯示的寡核苷酸表1SEQIDNO1和2的寡核苷酸包含與T7啟動子和核糖體結合位點互補的RNA-I序列，以及GFPcDNA的第一個60個核苷酸，并且利用SEQIDNO7和8的寡核苷酸進行擴增并且用于T7聚合酶介導的體外轉錄(參見實施例1)。SEQIDNO1的寡核苷酸包含RNAI的環1和環2(相當于圖4中的III)，SEQIDNO2的寡核苷酸包含RNAI的環2(相當于圖4中的II)。SEQIDNO3和4的寡核苷酸用來從ColE1質粒擴增RNAI(110bp)并摻入T7啟動子用于體外轉錄。SEQIDNO5和6的寡核苷酸用來從ColE1質粒擴增RNAII180nt并且摻入T7啟動子用于體外轉錄。SEQIDNO7和8也用來產生用作陰性對照的DNA(相當于圖4中的I)，利用pet11aGFP作為模板。陰性對照是帶有T7啟動子和核糖體結合位點的綠色熒光蛋白mRNA。實施例1利用體內轉錄的構建體的雜交實驗為了選擇與RNAI互補的序列(RNAII-樣序列)在mRNA分子中期望的長度以及位置，從而通過雜交抑制其翻譯，進行體外反義實驗。RNAI與不同的合成的RNAs以及與RNAII的RNA雜交體進行凝膠移位分析。為了這種目的，包含RNAII-樣序列的人工設計的GFP構建體在體外轉錄并且與體外轉錄的RNAI進行孵育。在非變性RNA-聚丙烯酰胺凝膠上檢測雜交。合成的RNAs(RNAI以及在其5’端帶有RNAII發夾結構的合成的構建體)通過體外轉錄(Ampliscribe，T7-FlashTranscriptionKit；Epicentre)得到(圖2)。各自從pBR322ori以及得自Metabion的寡核核苷酸(寡核苷酸SEQIDNO1和2)得到的110bp的RNAI和RNAII利用PCR擴增并且充當線性DNA模板用于體外轉錄。為了證實RNAI和RNAII-靶相互作用，進行凝膠移位實驗。由于它們看起來被阻滯了，環-環復合物清楚地呈現。在雜交之前，將RNAs分開地加熱。凝膠為75mm厚的5％(w/v)聚丙烯酰胺(60∶1)并且在用冰水冷卻的小蛋白凝膠儀(Pharmacia)上運行。運行緩沖液為包含5mMMgCl2的1xTris-borate(89mMTris(pH8.3)，89mM硼酸)。條帶用溴化乙錠染色并且利用UV透照燈觀察。當在轉錄物的開始部分帶有及不帶有RNAII序列的包括RBS和起始密碼子的60nt的GFPmRNA與RNAI孵育的時候，得到顯示在圖3中的結果。圖3的凝膠1顯示陽性(RNAII108nt，相應于完整的RNAI序列以及陰性對照。如果在兩種RNAs之間發生反應，(標記的)RNAI條帶顯示更弱，因為其被阻滯。凝膠11陰性對照RNA2RNAI+陰性對照RNA3RNAII108nt4RNAI+RNAII108nt(孵育前加熱(在90℃3分鐘)5RNAI+RNAII108nt6RNAI(孵育前加熱(在90℃3分鐘))7RNAI在圖3中的凝膠2上，道8、9和10，只顯示了RNAI帶。當與帶有一個RNAII環的轉錄物孵育的時候，看見非常弱的反應，而帶有兩個環的轉錄物給出強反應。凝膠28RNAI9RNAI(+RNAII環2)10RNAI(+RNAII環1和2)環2GFP(道9)顯示了些微變弱的RNAI條帶(與陰性對照相比)，而環1+2GFP道10)顯示了顯著降低的RNAI帶，顯示形成了相吻復合物。該數據表明RNA-RNA相互作用在只存在一個環的時候是有效的。將在凝膠上顯示形成相吻復合物-甚至弱的復合物的環構建體克隆到pMMB67EH和pBluescriptIIKS+中并且測試GFP表達。由于RNAI與包含兩個發夾環的標志物相互作用更強，該構建體被認為是對體內實驗合適的候選物。實施例2測試基因表達以及基因沉默的體內測定在進行測試的構建體中，一個或者兩個RNAII莖環克隆到表達載體中。轉錄物的二級結構以及適當的折疊通過計算機程序RNAfold(GeneQuest，ViennaRNAfoldingprocedure；參見Zuker，1999)所證實。對于該實驗，帶有非-ColE1起源的表達載體，例如pMMB67EH(Fürste等，1986)被認為可以用來解決質粒中的RNAI-靶相互作用并且判斷GFP表達是否被鄰近核糖體結合位點存在的其他的序列所阻礙。這被認為是很重要的，核糖體上或者核糖體附近的其他的序列以及二級結構通常引起下降或者甚至全部地抑制基因表達(Malmgren，1996；Ringquist，1993)。基于利用非變性RNA凝膠(參見實施例1)得到的結果，構建了GFP與RNAII-樣序列的兩種融合體(圖4)。兩種不同的RNAII-樣序列插入到GFP編碼序列的上游，在T7啟動子和lac操縱子的控制之下。Gfp基因從pGFPmut3.1利用引物NheI-GFP-back以及BamHI-GFP-for擴增得到(引物序列參見表2)。T7/lacO啟動子-帶有以及不帶RNAII環/RBS組合-基于引物(HindIII-T7GFP-back)以及用于擴增gfp的BamHI-GFP-for進行全合成，或者利用寡核苷酸進行合成(T7al3-oligo和T7L12ras-oligo)，并且融合到通過NheI限制性位點處理的擴增的gfp。利用BamHI和HindIII限制性處理將整個的片段克隆到pMMB67EH(引物以及寡核苷酸參見表2)。表2選擇的構建體構建體克隆到pMMB67EH載體以證實GFP表達，盡管鄰近核糖體結合位點存在其他的序列。二種構建體都產生GFP，但是表達顯著低于不帶發夾環的構建體。將兩種構建體克隆到包含Tn7同源區以及卡那霉素抗性基因的載體pBluescript中，起用于篩選具有將整個盒整合到染色體中能力的宿主。如前所述，將GFP盒插入到細菌染色體上。圖4顯示克隆到pMMB67EH并且還插入到HMS174(DE3)基因組中的構建體。盒分別為I)HMS174(DE3)T7GFP＝IS5，II)HMS174(DE3)T7al3GFP＝IS11以及III)HMS174(DE3)T7l12rasGFP＝IS13由于當克隆到pMMB67EH中的時候，T7aL3GFP和T7l12rasGFP顯示GFP表達，這些表達盒-以及作為陰性對照的T7GFP-插入到細菌染色體中用于檢測其充當反義RNAI靶的能力。利用BamHI和HindIII限制性位點，將構建體克隆到載體pBluescriptKSII+中。Tn7同源區從大腸桿菌HMS174(DE3)菌落擴增得到，利用引物NotI-Tn7/1-back和EcoRI-Tn7-for針對同源區1，以及引物XhoI-Tn7/2-back和KpnI-Tn7-for針對同源區2(引物序列參見表3)。對于卡那霉素抗性盒，其用于篩選具有整合到染色體中的完整的盒的宿主，選取源自pUC4K的EcoRI片段。T7終止子從表達載體pET11a擴增得到，利用引物XhoI-T7term-for以及EcoRI-T7term-for(表2)。完整的質粒利用NotI和KpnI消化(對于盒)并且利用Alw44I用于消化質粒骨架。凝膠純化的線性盒插入到攜帶MG1655的RedHelper質粒pKD46的細菌染色體上。攜帶插入片段的染色體部分轉染到HMS174(DE3)，利用P1轉導。表達盒的正確插入利用PCR證實(外引物(表3)和內引物)。表3針對株IS5、IS11和IS13的Tn7位點的引物由于選擇了染色體插入位點attTn7(deBoy和Craig，2000)，后者位于glmS的轉錄終止子之中的基因glmS和phoS之間的非編碼區。利用特定的Tn7引物，只有該轉錄終止子被盒替換。(Yu及其合作者證實40bp的同源區足以將線性片段整合到染色體中(Yu等，2000))。由于隨著同源區長度增加，得到更好的結果，其在一側延長到300bp并且在另外一側延長到240bp。由于HMS174(DE3)似乎不適于利用RedHelper質粒進行線性DNA的直接整合，MG1655用于初始整合并且通過P1轉導將重組染色體部分轉染到HMS174(DE3)中。得到的株HMS174(DE3)T7al3GFP＝IS5，HMS174(DE3)T7GFP＝IS11和HMS174(DE3)T7l12rasGFP＝IS13包含在T7啟動子控制下的GFP，分別地帶有或者不帶有RNAII環結構。表達盒的正確插入利用PCR證實。得到的株指定為I)IS5、II)IS11和III)IS13并且在搖瓶實驗中測試GFP表達以及RNAI-介導的基因沉默效應。對于搖瓶實驗，過夜的培養物以1∶100稀釋并且生長直至OD600～0.5。然后加入IPTG進行誘導。利用微量滴定板讀數器SPECTRAmaxGeminiXS以及軟件，SOFTmaxPro(Moleculardevices)測定熒光，激發波長為488nm，并且發射波長為530nm，截止濾光片515nm。當pBR322存在的時候，有以及沒有IPTG誘導下的GFP檢測顯示清楚的基因沉默作用(圖5)。IS13顯示更低的GFP表達，IS11對GFP表達的抑制非常小，而IS11顯示更高的GFP表達以及顯著的基因沉默作用，提供證據表明我們的思想的確可行。當在GFP-基因的上游不存在RNAII-樣序列(IS5)的時候，沒有檢測到基因沉默(圖6)。IS5利用不同的質粒轉化，包括pET11a、pET3d、pMMB67EH和pBR322，以檢測在質粒以及基因組基因表達之間的非期望的相互作用(圖6)。已經發現只有當GFPmRNA包含RNAII-樣序列并且使用在基因組上不包含與盒同源的序列的ColE1質粒，例如T7啟動子或者lac操縱子，才能夠觀察到確定的基因沉默效應。當使用通常用于基因治療中的pBR322相關的質粒的時候，在宿主和質粒之間沒有擾亂反義反應的干擾。圖5顯示了帶有以及不帶有pBR322的株IS11和IS13的比較。Rfu/OD為相對于光密度的熒光單位。在誘導1.5小時后觀察到GFP熒光的增加。圖6顯示了利用包含IS5的多種質粒的搖瓶實驗的結果。pBR322以及相關的質粒(如用于基因治療應用)顯示在宿主和質粒之間無干擾。實施例3在發酵期間的標志物基因的表達/抑制在補料-分批發酵過程中分析存在以及不存在質粒pBR322的大腸桿菌株IS11和IS5。表4總結了四批補料分批發酵的實驗設計。各株在存在或者不存在pBR322下生長。表4補料分批發酵所有的四種培養都對在線的信號方面顯示出來非常類似的趨勢，如CO2、O2、基本消耗或者產量，并且總BDM進程的變化也在非常小的范圍之內，小于計算平均值±10％，如圖7a和7b中所示。圖7a顯示了細菌干重(BDM)以及有或者無pBR322條件下的IS11的GFP表達。盡管對兩種發酵而言總BDM相同，當pBR322存在的時候，GFP濃度顯著下降(50％)。GFP測量的曲線進程強烈地表明GFP翻譯被質粒的存在因此其復制所抑制，并且證實RNAI以及修飾的GFP的mRNA相互作用從而妨礙翻譯的預期(圖7a)。為了排除pBR322對重組蛋白表達自身具有作用，利用IS5進行進一步的補料分批實驗，再次存在或者不存在質粒增殖。如圖7b中所示，在GFP表達或者細胞生長方面沒有差異無論pBR322在宿主中是否存在，不能檢測到對GFP轉錄或者翻譯的影響。在這些實驗中，總體的GFP表達遠高于使用株IS11的情形，這是由于天然mRNA的有效翻譯。盡管蛋白表達被IS11中鄰近核糖體結合位點的穩定的RNA環結構的存在而降低，當存在pBR322的時候，表達被抑制。因此，通過使用GFP作為有毒的標志物的替代物可以證實ColE1的復制調節系統可以用來抑制標志物基因的表達。實施例4利用阻抑蛋白用于調節必需基因的表達a)必需基因構建體的產生測試的第一個必需基因為map(Li等，2004，該基因為蛋氨酸氨基肽酶，其位于大腸桿菌染色體的min4處，距離rpsB-tsf操縱子357個堿基對以及距離T44-RNA基因201bp。這兩種基因分開轉錄并且啟動子不相互重疊。這是很重要的一點，因為必需基因的啟動子被完全去除并且利用被對選擇的阻抑蛋白特異的可誘導的啟動子替換。Chang等，1989記載了有條件地致死突變株，其具有被lac啟動子控制的map基因。利用map盒，67bp的染色體部分被包含map啟動子替換(Chang等，1989)。為了解決從基因組的可能的轉錄物，源自rrnB操縱子的兩個強轉錄終止子T1和T2(Brosius等，1981)加入到整合盒中。測試的第二種基因為murA(Brown等，1995)，其已經描述為必需的大腸桿菌基因。基因murA編碼用于細菌細胞壁生物合成第一步驟的酶UDP-N-乙酰基葡(萄)糖胺enolpyruvyl轉移酶，位于大腸桿菌染色體69.3min處，在其文章中，Herring和Blattner比較了數種條件的致死琥珀突變體的死亡曲線(HerringandBlattner，2004)，其中也包括那些map和murA突變體。但是所有的突變murA具有最強的殺菌作用，在非許可的(non-permissive)培養基中顯示最好以及最快的殺死速率。圖8顯示基于包括必需基因啟動子替換的必需基因的構建體原理。用于基因組整合的構建體再次克隆到載體pBluescriptKSII+中。必需基因同源區，每種～300bp，擴增自MG1655菌落，利用引物對SacI-map1-for/NotI-map1-back以及XhoI-map2-back/KpnI-map2-for針對map同源區，以及引物對SacI-murA1-for/NotI-murA1-back以及XhoI-murA2-back/KpnI-murA2-for針對murA同源區(引物序列參見表5)。包含乳糖啟動子和操縱子的片段(plac)從pBluescriptKSII+擴增，利用引物BamHI-placO-back和NotI-placO-for。氯霉素乙酰轉移酶(cat)的基因從pLys(pACYC184)擴增得到，利用引物HindIII-SalI-Cat-back和XhoI-Cat-for。rrnBT12終止子從pBAD擴增得到，利用引物BamHI-T12-for和HindIII-T12-back。裝配的載體pBSKmap<plac-T12-Cat>以及pBSKmurA<plac-T12-Cat>利用SacI和KpnI消化，并且將線性化的盒插入到MG1655基因組中，如前所述。盒的正確整合利用PCR結合外引物(map1extern，map2extern，murA1extern，murA2extern；表5)以及內引物證實。針對必需的以及測試基因構建體的引物顯示在表5中。表5如果同源區引物選擇正確，只有在IPTG存在的條件下能夠預期基因組整合后的菌落。在引物NotI-map/murA-for上沒有提供核糖體結合位點(RBS)，由于并不準備利用盒替換天然的RBS以盡可能地將基因的表達模式保持在正常的情形下。因此目標在于替換必需基因之前的任何啟動子但是保持天然的RBS完整。在轉化之后，無論是map還是murA突變體在LB-CM板上都沒有生長，但是它們在LB-CM板以及包含0,1mmolIPTG/L的液體培養基上生長良好，表明引物的選擇是正確的并且plac以及終止子正確地發揮了作用。但是，在進一步的培養中，map突變體在板以及不含IPTG的液體培養基上顯示了輕微的生長。由于murA突變體在非許可的培養基上不顯示任何生長，murA構建體選擇作為篩選系統的基礎。b)用于阻抑作為必需基因替代物的GFP測試構建體的產生以pBluescriptKSII+作為例證的構建體的原理顯示在圖9中。質粒pBSKTn7<pLtetOgfp-T7aL3tetR-Cat>以數個連續的克隆步驟從作為起始載體的pBSKTn7<T7al3GFP>以及包含單個片段的中間質粒構建得到(引物序列參見表5和6)。Tn7同源區1從細菌模板擴增，利用引物SacI-Tn7/1-back和EcoRI-Tn7/1-for，Tn7同源區2利用引物XhoI-Tn7/2-back和KpnI-Tn7/2-for進行擴增，rrnBT12終止子利用引物EcoRI-T12-back和HindIII-SalI-T12for進行擴增，并且cat基因利用引物HindIII-SalI-Cat-back和XhoI-Cat-for進行擴增(表5)。四環素阻抑蛋白基因(tetR)從包含Tn10的四環素抗性株IS1(HMS174(DE3)ilv500::Tn10)利用引物NheI-tetR-back和BamHI-tetR-for進行擴增。tet-可誘導的pLtetO啟動子利用引物(HindIII-PLtetO-NotI-RBS-GFPback)以及用于擴增gfp的引物EcoRI-GFP-進行全合成。對于基因組整合，裝配的載體pBSKTn7<pLtetOgfp-T7al3tetR-Cat>再次利用SacI和NotI消化以釋放需要的表達盒。表6用于測試構建體的另外的引物c)利用插入到HMS174(DE3)(＝K12)基因組中測試構建體的搖瓶實驗帶有以及不帶有pBR322的HMS174(DE3)Tn7pLtetOgfpT7aL3tetRCat(HMS-GTC)過夜培養物以1∶100稀釋在半合成的培養基中，并且分成帶有以及不帶誘導劑IPTG的兩個平行的搖瓶培養。在37℃振蕩下將培養物生長。當搖瓶達到OD600nm大于0.7的時候，開始取樣進行gfp-ELISA。進行帶有HMS-GTC的搖瓶實驗以測試合成的啟動子pLtetO是否工作以及在其N-端帶有小的融合肽(環3)的tetR在操縱子-結合中是否仍然有效。誘導的培養基包含0.1mmolIPTG，并且在OD0.5的時候增加至0.5mmolIPTG。高量的IPTG是誘導瓶中生長抑制的原因(圖10)。IPTG加入關閉了gfp基因的轉錄，表明反應級聯發揮作用良好。在誘導瓶中的低-以及不變的-基礎GFP水平明顯地由源自不帶IPTG的過夜培養物中的殘留的GFP引起。HMS-GTC搖瓶結果與同樣的宿主以及包含MG1655-GTC的質粒pBR322的搖瓶實驗進行比較。MG1655缺少DE3前噬菌體以及由此的T7-聚合酶并且因此充當陰性對照。pBR322的存在總是顯示增加的GFP表達。在表7中，計算在搖瓶中的ngGFP/OD的平均比率(質粒/無質粒)，并且比較了包含染色體拷貝的盒以及不同誘導策略的兩種宿主。表7當包含HMS-GTC的質粒在培養開始的時候誘導的時候，與沒有質粒的搖瓶相比，測量到輕微的增加(系數1.44)的GFP表達。但是，這種輕微的增加(系數1.43)在MG1655-GTC中也測量到，顯示這種GFP累積可能是由質粒引起而不是通過RNAI-反義反應引起。當達到0.5的OD600nm加入IPTG的時候，得到完全不同的結果。盡管基礎的GFP水平更高，當pBR322存在于細胞中的時候，GFP表達中有明確的上升，這里RNAI以及其與RNAII環3的反義反應是誘導劑IPTG的拮抗劑。但是，IPTG是強烈的誘導劑并且RNAI-環3反義反應相對較弱。在沒有誘導下，在HMS-GTCpBR322中也觀察到多于2倍增加(系數2.29)的GFP(表7)。這可以通過T7系統的泄漏進行解釋(Studier和Mofatt，1986)并且也是反義反應的間接證據。由于T7-聚合酶的基礎水平，少量的TetR存在于細胞中。并且由于TetR是強烈的以及有效的阻抑蛋白分子，這種小量也足以抑制GFP表達至系數2.29。當源自pBR322的RNAI存在的時候，其能夠“處理”少數的tetRmRNA分子并且GFP水平上升。參考文獻Balbas，P.，Soberon，X.，Bolivar，F.andRodriguez，R.L.Theplasmid，pBR322.Biotechnol10，5-41(1988)Balbas，P.，(2001).UnderstandingtheArtofProducingProteinandNonproteinMoleculesinEscherichiacoli.Mol.Biotechnol.Nov；19(3)251-67.Bahl.，C.P.，Wu，R.，Stawinsky，J.，Narang，S.A.(1977)Minimallengthofthelactoseoperatorsequenceforthespecificrecognitionbythelactoserepressor.Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，966-970.Beck，C.F.，Mutzel，R.Barbe′，J.，Müller，W.A.(1982)Amultifunctionalgene(tetR)controlsTn10-encodedtetracyclineresistance.J.Bacteriol.150，633-642.Bernard，P.，Couturier，M.(1992).CellkillingbytheFplasmidCcdBproteininvolvespoisoningofDNAtopoisomeraseIIcomplexes.JMolBiol.，Aug5，2263735-45Bhagwat，A.S.andPerson，S.StructureandpropertiesoftheregionofhomologybetweenplasmidspMB1andColE1.MolGenGenet182，505-507(1981)Bolivar，F.MolecularcloningvectorsderivedfromtheCoLE1typeplasmidpMB1.LifeSci25，807-817(1979)BrosiusJ，UllrichA，RakerMA，GrayA，DullTJ，GutellRR，NollerHF(1981).ConstructionandfinemappingofrecombinantplasmidscontainingtherrnBribosomalRNAoperonofE.coli.Plasmid.Jul；6(1)112-8.Brown，E.D.，Vivas，E.I.，WalshC.T.，Kolter，R.(1995)MurA(MurZ)，theenzymethatcatalyzesthefirstcommittedstepinpeptidoglycanbiosynthesis，isessentialinEscherichiacoli.JournalofBacteriology，Vol.177，No.14，4194-4197.Casali，N.，(2003)，Escherichiacolihoststrains.MethodsMol.Biol.253，27-48.Cesareni，G.，Helmer-Citterich，M.，Castagnoli，L.(1991).ControlofColE1plasmidreplicationbyantisenseRNA.TrendsGenet.Jul77，230-5Chan，P.T.，Ohmori，H.，Tomizawa，J.，Lebowitz，J.(1985).NucleotidesequenceandgeneorganizationofColE1DNA.JBiolChem，1985，Jul25，26015，8925-35Chang，A.C.Y.，andCohen，S.N.ConstructionandcharacterizationofamplifiablemulticopyDNAcloningvehiclesderivedfromtheP15Acrypticminiplasmid.JournalJ.Bacteriol.Vol.134，11411156，(1978)ChangSY，McGaryEC，ChangS.(1989).MethionineaminopeptidasegeneofEscherichiacoliisessentialforcellgrowth.JBacteriol.Jul；171(7)4071-2Chen，W.，Graham，C.，andCiccarelli，R.B.(1997).Automatedfed-batchfermentationwithfeed-backcontrolsbasedondissolvedoxygen(DO)andpHforproductionofDNAvaccines.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，18，43-48.Craig，N.LTransposonTN7.InBerg，D.EandHowe，M.H.(Eds.)，MobileDNA.AmericanSocietyofMicrobiology，WashingtonDC，(1989)，211-225.Crozat，A.，Aman，P.，Mandahl，N.，Ron，D.(1993).FusionofCHOPtoanovelRNAbindingproteininhumanmyoxidliposarcoma.Nature363，640-644Datsenko，K.，andWanner，B.(2000).One-stepinactivationofchromosomalgenesinE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212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9gatgatgctagcaaaggagaagaac25<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10gatgatggatccttatttgtatagttc27<210>11<211>122<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11taatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattt60tgtttaactttaagaaggagatacatatgggtaactggcttcagcagagcgcagatacca120tg122<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12atcatcgctagccatggtatctgcgctctgctg33<210>13<211>123<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13taatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccccaacaaaaaaaccac60cgctaccagcggtggtttgtttgcctctagttcagctaccaactgaaggagagaatacat120atg123<210>14<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14atcatcgctagccatatgtattctctccttc31<210>15<211>119<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15gatgataagctttaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctc60tagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatggctagcaaaggagaag119<210>16<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16gatgataagctttaatacgactcactataggg32<210>17<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>17gatgatctcgagcaaaaaacccctcaagacc31<210>18<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>18agtagtgaattccaaaaaacccctcaagacc31<210>19<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>19gatgatgcggccgcgttgcgacggtggtacg31<210>20<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>20gatgatgaattctatgtttttaatcaaacatcctg35<210>21<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>21gatgatctcgaggcatccatttattactcaacc33<210>22<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>22gatgatggtacctgaagaagttcgcgcgcg30<210>23<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>23accggcgcagggaagg16<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>24tggcgctaattgatgccg18<210>25<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>25atgatgatggcggccgcaccgacgctgatggacagaattaatgg44<210>26<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>26gctgctgagctcccatctttgattacggtgac32<210>27<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>27atgatgctcgagcgccaaacgtgccactg29<210>28<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>28gctgctggtaccgaagtgaacaccagccttg31<210>29<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>29ttcgggttccagtaacggg19<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>30tttcgaggtatcgccgtgg19<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>31gctgctgagctccaaagcgcgctaccagcg30<210>32<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>32atgatgatggcggccgcttaactgagaacaaactaaatgg40<210>33<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>33atgatgctcgaggctcaaaagccgttcagtttg33<210>34<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>34gctgctggtacctgccagcgcaactttgctc31<210>35<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>35gtacaaccgccaggtagtg19<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>36gtctgatttatcagcgaggc20<210>37<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>37gctgctaagcttgtcgacagccactggagcacctc35<210>38<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>38atgatgctcgagacggggagagcctgagc29<210>39<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>39atgatgggatccaaaaggccatccgtcagg30<210>40<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>40gtcgtcaagcttataaaacgaaaggctcagtc32<210>41<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>41gctgctggatccgcgcccaatacgcaaacc30<210>42<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>42atgatgatggcggccgctgtgaaattgttatccgctc37<210>43<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>43gctgctgaattcataaaacgaaaggctcagtc32<210>44<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>44gctgctaagcttgtcgacaaaaggccatccgtcagg36<210>45<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>45gatgatgaattctatgtttttaatcaaacatcctg35<210>46<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>46gatgatgagctcgttgcgacggtggtacg29<210>47<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>47gatgatctcgaggcatccatttattactcaacc33<210>48<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>48gatgatggtacctgaagaagttcgcgcgcg30<210>49<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>49gctgctgctagcatgatgtctagattagataaaag35<210>50<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>50gctgctggatccttaagacccactttcacatttaag36<210>51<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>51gtcgtcgaattcttatttgtatagttcatccatgc35<210>52<211>116<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>52gctgctaagctttccctatcagtgatagagattgacatccctatcagtgatagagatact60gagcacatcgcggccgctttaagaaggagatatacatatgcgtaaaggagaagaac116<210>53<211>24<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichiacoli)<220><223>Lac操縱子<400>53tggaattgtgagcggataacaatt2權利要求1.一種非天然存在的細菌細胞，包含i)編碼表達可被調節的蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列可操作地連接至下述序列，ii)DNA序列，編碼模擬RNAII序列或者其部分的RNA序列，所述的RNA序列互補于可從帶有ColE1復制起點的質粒轉錄的RNAI序列。2.權利要求1的細菌細胞，包含整合到其基因組中的所述的DNA序列i)和ii)。3.權利要求1或2的細菌細胞，其中所述的DNA序列i)對所述的細胞而言是外源的DNA序列。4.權利要求3的細菌細胞，其中所述的外源的DNA序列i)編碼對所述的細胞而言是致死的或者有毒的蛋白。5.權利要求4的細菌細胞，其中所述的外源的DNA序列i)在可誘導的啟動子控制下。6.權利要求4的細菌細胞，其中所述的外源的DNA序列i)編碼蛋白，所述的蛋白本身對于所述的細胞是致死的或者有毒的或者通過產生有毒的物質。7.權利要求4的細菌細胞，其中所述的外源的DNA序列i)編碼對所述的細菌細胞致死的或者有毒的阻抑蛋白，通過阻抑對所述的細胞的生長必需的基因的轉錄。8.權利要求7的細菌細胞，其被改造成使所述的必需基因可操作地連接到啟動子，該啟動子包含被所述的阻抑蛋白識別并且特異地結合的DNA序列。9.權利要求8的細菌細胞，其中連接至所述的必需基因的所述的啟動子是可誘導的。10.權利要求9的細菌細胞，其中所述的可誘導的啟動子是可誘導的，獨立于權利要求5的可誘導的啟動子。11.權利要求1的細菌細胞，其中所述的DNA序列ii)插入到所述的DNA序列i)的核糖體結合位點以及起始密碼子之間。12.權利要求1的細菌細胞，其中連接所述的DNA序列i)以及所述的DNA序列ii)以使其編碼融合蛋白。13.權利要求1的細菌細胞，其中所述的DNA序列i)以及所述的DNA序列ii)翻譯地偶聯。14.權利要求1～13中任一項的細菌細胞，其具有復制帶有ColE1復制起點的質粒的能力。15.權利要求14的細菌細胞，其為大腸桿菌細胞。16.宿主-載體系統，包括a)帶有ColE1復制起點的質粒；b)其中所述的質粒a)能夠被復制的細菌宿主細胞，包含i)編碼表達可被調節的蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列可操作地連接至下述序列，ii)DNA序列，編碼模擬RNAII序列或者其部分的RNA序列，所述的RNA序列互補于可從質粒a)轉錄的RNAI序列；其中在ii)中定義的所述的RNA序列，在不存在質粒a)的情形下，容許所述的蛋白的表達以及其中，當所述的質粒a)存在于所述的宿主細胞中的時候，從質粒轉錄的RNAI分子與在ii)中定義的所述的RNA序列雜交，從而所述的蛋白的表達被抑制。17.權利要求16的宿主-載體系統，其中所述的細菌宿主細胞b)是在權利要求2～13以及15中任一項定義的細菌細胞。18.權利要求16或者17的宿主-載體系統，其中所述的外源的DNA序列i)編碼對所述的細菌細胞而言致死的或者有毒的蛋白，并且其中在ii)中定義的所述的RNA序列在缺失質粒a)的情形下，容許所述的致死的或者有毒的蛋白的表達以使所述的宿主細胞的生長被全部或者部分地抑制，并且其中，當所述的質粒a)存在于所述的宿主細胞中，從質粒轉錄的RNAI分子與在ii)中定義的所述的RNA序列雜交，從而所述的致死的或者有毒的蛋白的表達被抑制從而帶有質粒的細胞的完全或者部分生長抑制被取消。19.權利要求16的宿主-載體系統，其中所述的質粒a)另外地包含感興趣的基因。20.一種產生質粒DNA的方法，包括下述步驟i)利用具有ColE1復制起點并且包含感興趣基因的質粒的轉化權利要求4的細菌宿主細胞群，所述的感興趣的基因在所述的細菌宿主細胞中不從所述的質粒表達，ii)將所述的細菌宿主細胞群在所述的致死的或者有毒的蛋白在細胞中可以表達的條件下生長，從而所述的蛋白的表達全部地或者部分地抑制無質粒-細胞的生長，從而攜帶質粒的細胞的生長超過無質粒的細胞，iii)富集攜帶質粒細胞，并且iv)分離并純化質粒DNA。21.一種制備感興趣的蛋白的方法，包括下述步驟i)利用具有ColE1復制起點并且包含編碼感興趣蛋白的DNA序列的質粒轉化權利要求4的細菌宿主細胞群，所述的DNA序列在原核啟動子的控制下能使所述的蛋白在所述的細菌宿主細胞中表達；ii)將所述的細菌宿主細胞群在所述的致死的或者有毒的蛋白在細胞中可以表達的條件下生長，從而所述的蛋白的表達全部地或者部分地抑制無質粒-細胞的生長，從而攜帶質粒的細胞的生長超過無質粒的細胞，iii)富集感興趣的蛋白，并且iv)分離并且純化該蛋白。全文摘要宿主－載體系統，利用ColE1－型質粒的基于RNA－拷貝數控制機制用于調節標志物基因的表達，容許進行質粒的無抗生素篩選并且可以用于產生質粒DNA和重組蛋白。文檔編號C12N15/70GK101052722SQ200580037778公開日2007年10月10日申請日期2005年9月8日優先權日2004年9月17日發明者萊因加德·格拉貝爾,艾琳·普法芬澤勒申請人:貝林格爾·英格海姆奧地利有限公司