一種鼠李糖苷酶的生產方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及鼠李糖苷酶領域，特別是涉及一種鼠李糖苷酶的生產方法。
【背景技術】
[0002]鼠李糖苷酶是一種水解酶。鼠李糖苷酶的來源比較廣，廣泛分布于自然界的細菌和真菌中。國內關于鼠李糖苷酶研究，主要集中在代謝產生的鼠李糖苷酶，國外研究相對較多，主要有黑曲霉、白曲霉、棘孢曲霉、青霉菌、擬桿菌屬和熱微菌門等。鼠李糖苷酶在實際工藝中具有很多潛在的應用價值，如工業上用于去除柑桔汁中柚皮苷的苦味，將橘皮苷水解為鼠李糖和橘皮素糖苷等。其中橘皮素糖苷是工業生產甜味劑的重要前體物。另外，鼠李糖苷酶可以作用于萜烯基糖苷，在改善葡萄汁和飲料的香氣成分方面有很重要的應用。它在食品、醫藥、飼料等行業中得到了廣泛應用。其工業化生產是利用微生物發酵法生產，但該方法存在發酵活力低、產量低、生產成本高等限制性因素，故為了克服上述問題，技術人員在應用各種遺傳學手段提高微生物的生產性能方面，做了大量工作，而對通過培養方法的改進來提高發酵性能方面所做的工作還有所欠缺。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種工藝簡單、發酵活力高的鼠李糖苷酶的生產方法。
[0004]—種鼠李糖苷酶的生產方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0005](I)取細麗毛殼菌種按5?20%的接種量接種于一級種子培養基中，在25?38°C培養10?30h，控制溶氧在60%以上，培養即得一級種子液；
[0006](2)將所述一級種子液按5?20%的接種量接種于二級種子培養基中，在25?38°C培養10?30h，控制溶氧在60 %以上，培養即得二級種子液；
[0007](3)將所述二級種子液按5?20%的接種量接種于發酵培養基中，在25?38°C培養40?55h，控制溶氧在60%以上，得到混合培養基，后按每升混合培養基添加5?1g蔗糖的比例添加蔗糖，并開始按每升混合培養基流加橘皮苷0.5?5g/小時的比例添加橘皮苷，同時控制pH為4.5?5.5，培養70?96h后即得酶活達到500U/mL以上的鼠李糖苷酶發酵液，其中，所述發酵培養基的成分為:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化鈉3?5g/L、磷酸二氫銨2?3g/L、硫酸鎂0.5?lg/L、氯化鋅0.2?0.5g/L、丙酸鈣20?30g/L;
[0008](4)將所述鼠李糖苷酶發酵液進行過濾，除去菌體及其他微小顆粒，后對濾液超濾濃縮，直至得到酶活達到1250U/mL以上的鼠李糖苷酶酶液；
[0009](5)將所述鼠李糖苷酶酶液以淀粉為載體，進行噴霧干燥，即可得到酶活達到3500U/mL以上的固體鼠李糖苷酶；
[0010]其中，步驟(I)中的所述一級種子培養基和步驟(2)中的所述二級種子培養基的成分都為:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化鈉3?5g/L、磷酸二氫錢2?3g/L、硫酸鎂0.5?lg/L、氯化鋅0.2?0.5g/L、丙酸鈣20?30g/L。
[0011 ]在其中一個實施例中，所述一級種子培養基、所述二級種子培養基的成分都為:橘皮苷60g/L、酵母抽提物15g/L、氯化鈉3g/L、磷酸二氫錢3g/L、硫酸鎂lg/L、氯化鋅0.2g/L、丙酸鈣20g/L。
[0012]在其中一個實施例中，步驟(2)中，所述發酵培養基的成分為:橘皮苷60g/L、酵母抽提物10g/L、氯化鈉5g/L、磷酸二氫銨3g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鋅0.5g/L、丙酸鈣30g/L。
[0013]在其中一個實施例中，步驟(3)中，通過添加氨水的方式控制pH為5.0?5.5。
[0014]在其中一個實施例中，步驟(1)、(2)、(3)中控制溶氧的方法都為:在培養過程中，調整攪拌轉速或通入無菌空氣控制溶氧在60%以上。
[0015]在其中一個實施例中，步驟(4)中，將鼠李糖苷酶發酵液通過板框過濾方法，除去菌體及其他微小顆粒。
[0016]上述鼠李糖苷酶的生產方法，通過在發酵培養基中控制鼠李糖的加入量，從而控制菌體生長速度，防止發酵培養后期菌體生長后勁不足；另外，在發酵培養基中加入蔗糖，可以限制鼠李糖苷酶對橘皮苷的作用，減少鼠李糖的產生，有利于促進鼠李糖苷酶的合成。
[0017]上述鼠李糖苷酶的生產方法，工藝簡單、操作容易、生產效率高，且生產的鼠李糖苷酶活力高，穩定性好，易于儲存。
【具體實施方式】
[0018]為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面對本發明的【具體實施方式】做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本發明。但是本發明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施的限制。
[0019]—實施方式的鼠李糖苷酶的生產方法，包括以下步驟:
[0020]取細麗毛殼菌種按5?20%的接種量接種于一級種子培養基中，在25?38°C培養10?30h，控制溶氧在60 %以上，培養即得一級種子液。
[0021 ]其中，一級種子培養基的成分為:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化鈉3?5g/L、磷酸二氫銨2?3g/L、硫酸鎂0.5?lg/L、氯化鋅0.2?0.5g/L、丙酸鈣20?30g/L0
[0022]將所述一級種子液按5?20%的接種量接種于二級種子培養基中，在25?38°C培養10?30h，控制溶氧在60%以上，培養即得二級種子液。
[0023]其中，二級種子培養基的成分為:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化鈉3?5g/L、磷酸二氫銨2?3g/L、硫酸鎂0.5?lg/L、氯化鋅0.2?0.5g/L、丙酸鈣20?30g/L0
[0024]將所述二級種子液按5?20%的接種量接種于發酵培養基中，在25?38°C培養40?55h，控制溶氧在60%以上，得到混合培養基，后按每升混合培養基添加5?1g蔗糖的比例添加蔗糖，并開始按每升混合培養基流加橘皮苷0.5?5g/小時的比例添加橘皮苷，同時控制pH為4.5?5.5，培養70?96h后即得酶活達到500U/mL以上的鼠李糖苷酶發酵液。
[0025]其中，所述發酵培養基的成分為:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化鈉3?5g/L、磷酸二氫銨2?3g/L、硫酸鎂0.5?lg/L、氯化鋅0.2?0.5g/L、丙酸鈣20?30g/L0
[0026]優選的，發酵培養基的成分為:橘皮苷60g/L、酵母抽提物15g/L、氯化鈉3g/L、磷酸二氫銨3g/L、硫酸鎂I g/L、氯化鋅0.2g/L、丙酸鈣20g/L。
[0027]控制pH值步驟為:通過添加氨水的方式控制pH為5.0?5.5。
[0028]上述中控制溶氧的方法都為:在培養過程中，調整攪拌轉速或通入無菌空氣控制溶氧在60%以上。
[0029]將鼠李糖苷酶發酵液進行過濾，除去菌體及其他微小顆粒，后對濾液超濾濃縮，直至得到酶活達到1250U/mL以上的鼠李糖苷酶酶液。
[0030]優選的，將鼠李糖苷酶發酵液通過板框過濾方法，除去菌體及其他微小顆粒。
[0031]將鼠李糖苷酶酶液以淀粉為載體，進行噴霧干燥，即可得到酶活達到3500U/mL以上的固體鼠李糖苷酶。
[0032]噴霧干燥方法的優點為:生產效率高，生產能力大，且產品質量高。淀粉作為載體可以充當鼠李糖苷酶的保護劑，減少儲存過程中的損失。
[0033]在鼠李糖苷酶發酵生產中，蔗糖作為菌體利用的碳源，可以使發酵緩慢持續進行，橘皮苷作為鼠李糖苷酶生產的誘導物，其代謝產物鼠李糖會阻礙鼠李糖苷酶的合成。為此，本發明在發酵初期，在發酵培養基中降低蔗糖和橘皮苷的加量，控制菌體生長速度，防止發酵后期菌體生長后勁不足，及防止鼠李糖的大量累積，阻礙鼠李糖苷酶的合成；同時在發酵培養基中添加丙酸鈣既可以作為孢子附著的載體，有利于細麗毛殼菌的生長，又可以抑制雜菌的產生，有效緩解PH下降過快，減輕鼠李糖的阻礙作用。到發酵中期，發酵液中蔗糖和橘皮苷的濃度下降，此時流加蔗糖和橘皮苷既可以維持菌體的生長，又可以持續誘導鼠李糖苷酶的合成。
[0034]本發明的鼠李糖苷酶的生產方法工藝簡單、操作容易、生產效率高，且生產的鼠李糖苷酶活力高，穩定性好，易于儲存。
[0035]下面結合具體實施例，對本發明作進一步的闡述。
[0036]實施例1
[0037]—種鼠李糖苷酶的生產方法，包括以下步驟:
[0038](I)取細麗毛殼菌種按5%的接種量接種于一級種子培養基中，在38°C培養30h，控制溶氧在60 %以上，培養即得一級種子液。
[0039]其中，一級種子培養基的成分為:橘皮苷60g/L、酵母抽提物15g/L、氯化鈉3g/L、磷酸二氫銨3g/L、硫酸鎂I g/L、氯化鋅0.2g/L、丙酸鈣20g/L。
[0040](2)將所述一級種子液按5的接種量接種于二級種子培養基中，在38°C培養30h，控制溶氧在60 %以上，培養即得二級種子液。
[0041 ]其中，二級種子培養基的成分為:橘皮苷60g/L、酵母抽提物15g/L、氯化鈉3g/L、磷酸二氫銨3g/L、硫酸鎂I g/L、氯化鋅0.2g/L、丙酸鈣20g/L。
[0042](3)將所述二級種子液按20%的接種量接種于發酵培養基中，在25°C培養40h，控制溶氧在60%以上，得到混合培養基，后按每升混合培養基添加5g蔗糖的比例添加蔗糖，并開始按每升混合培養基流加橘皮苷5g/小時的比例添加橘皮苷，同時控制pH為4.5，培養96h后即得酶活達到500U/mL以上的鼠李糖苷酶發酵液。
[0043]其中，所述發酵培養基的成分為:橘皮苷60g/L、酵母抽提物10g/L、氯化鈉5g/L、磷酸二氫銨3g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鋅0.5g/L、丙酸鈣30g/L。
[0044](4)將鼠李糖