一種快速鑒定食用向日葵雜交種sh363真實性和純度的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農業分子生物學領域，具體涉及一種快速鑒定食用向日葵雜交種 SH363真實性和純度的方法。
【背景技術】
[0002] 向日葵（Helianthus annuusL.)為菊科（Composicae)向日葵屬的雙子葉植物，向 日葵屬由51個種和19個亞種組成，其中多年生向日葵37種，一年生向日葵14種。向日 葵原產于北美洲西南部，是唯一一種起源和馴化于北美洲并在全球范圍內大面積栽培的作 物。向日葵分為油用型向日葵和食用型向日葵，染色體基數均為17,有二倍、四倍、六倍不 同倍數水平，其中栽培種為二倍體，屬蟲媒異花授粉作物，野生種在二倍、四倍、六倍等不同 倍數水平均有發現。自上世紀60年代以來，向日葵在世界各地得到迅速發展，其油脂產量 僅次于大豆。目前，世界上已有40多個國家種植，其中原蘇聯、阿根廷、東歐、美國、中國、法 國、西班牙等七個國家和地區的向日葵栽培面積約占全球栽培面積的80%，2012年我國向 日葵栽培面積達88. 9萬公頃，主要分布在內蒙古、新疆、東北、甘肅、寧夏、陜西、山西、河北 等地，總產達232萬噸。向日葵屬喜光性短日植物，全生育期有效積溫彡1800~2600°C ; 耐旱耐鹽堿，耐瘠薄，對土壤有極廣的適應性，最適宜的土壤為壤土和沙壤土。因此，在我國 北方干旱、降雨少、土壤鹽堿化嚴重的地區，向日葵成為當地農民脫貧致富、增產增收的經 濟作物。近幾年來，我國對于向日葵的生產得到的長足的發展，已通過不同的方式從國外不 斷引進優良的雜交品種，目前我國已育成40多個油用雜交向日葵品種，市場上推廣的雜交 向日葵品種已有100余種。隨著向日葵育種技術的不斷發展和雜交品種的廣泛推廣，向日 葵雜交種的真實性與品種純度鑒定已越來越成為新品種保護以及保護種植戶利益的必要 手段。
[0003] 傳統的向日葵雜交種的真實性與品種純度鑒定方法依靠田間小區種植鑒定方法， 在苗期、蕾期、花期、灌漿期以及對收獲后的種子等進行觀測鑒定，主要依據向日葵的株、 葉、花、種子的特征特性加以評價和判斷。但上述鑒定方法存在如下缺陷：（1)受到經驗的 限制，沒有完全一致的評判標準；（2)在向日葵生長期間的鑒定還容易受到氣候與栽培條 件的影響，引起誤差或誤判；(3)需投入大量的人力、物力，成本高、耗時長，時效性差，對市 場與生產的指導不及時，難以避免給生產上帶來的損失。
[0004] 隨著分子生物學技術的發展，分子標記技術越來越多的應用于農作物種子的真實 性與品種純度鑒定。分子標記鑒定技術是以DNA分子多態性為基礎的一種遺傳標記，能穩 定遺傳，可以反映生物的個體和群體特征。由于分子標記可以直接反映 DNA水平上的差 異，具有高度的專一性和特異性，用于鑒定種子純度的分子標記主要的方法有RAPD、SSR和 SCAR。其中SSR(simple sequence repeats)標記技術具有數量豐富、多態性高、共顯性遺 傳、擴增穩定、易于檢測等方面的優點，已在許多農作物遺傳連鎖圖譜的構建、遺傳多樣性、 標記和定位基因以及分子標記輔助方面的應用。SSR標記通常具有共顯性的特點，匕雜交 種具有雙親等位基因的互補帶型。鑒于不育系和其同型保持性遺傳背景基本一致，只在不 育基因、保持基因等特征基因上存在差異，據此特征基因選擇DNA分子標記進行分析，從而 實現有效地區別和鑒定。SSR標記已成為現階段用于鑒定種子純度的常用方法，已廣泛應 用于玉米、水稻、大豆的新品種純度鑒定。但是目前在食用向日葵雜交種使用SSR分子標記 技術鑒定其真實性和純度的報道鮮有，建立一套適于食用向日葵雜交種真實性和純度鑒定 的SSR分子標記技術具有重要意義，可以克服傳統的田間小區種植鑒定所帶來的不足。
[0005] SH363是北京三瑞農業科技有限公司2010年選育的食用向日葵晚熟雜交種，其親 本組合為A436XR1843,生育期為115-125天；幼苗綠莖，生長整齊，長勢旺；葉片平展，卵圓 形，葉片數30片左右，葉色深綠，葉片大，株型整齊清秀。開花期一致，舌狀花黃色。花盤直 徑20厘米左右，植株彎曲度較大，株高220厘米左右，莖桿粗壯韌性極好，抗倒伏能力極強； 平均單盤粒數多，結實率85%左右，粒長2. 0-2. 3厘米，千粒重185g左右；籽粒為黑色白邊 有不規則白色條紋，潔凈，口感香甜，商品性極好，籽粒飽滿，籽仁率可達到50-55%。該品 種成熟時葉片干凈，抗霜霉病，抗黃萎病；菌核病的發生率很低。該品種產量三要素協調， 豐產性良好，一般畝產340公斤左右。適合中高肥力的田塊種植。田間表現整齊，高抗病， 抗倒伏，耐鹽堿。為保證該優質品種的最大經濟效益及其產業化的發展，需要一種權威的、 高效準確的檢測方法來鑒定所述食用向日葵雜交種SH363的真實性和品種純度，加快雜交 種的質量檢測進程。
【發明內容】
[0006] 為此，本發明所要解決的技術問題在于提供一種快速鑒定食用向日葵雜交種 SH363真實性和純度的方法，所述方法方便、快捷，操作步驟簡單，能夠在短時間內對大量的 待測食用向日葵雜交種SH363樣品進行快速鑒定，且測定結果準確。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明提供了一種快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實 性和純度的方法，包括如下步驟：
[0008] (1)分別取由待測食用向日葵雜交種SH363以及標準向日葵種子A436和R1843種 植得到的向日葵真葉為材料，利用常規的CTAB法提取上述各食用向日葵的基因組DNA ;
[0009] (2)以步驟（1)所得的各所述基因組DNA為模板，設計如下SR-366、SR-495、 SR-1067和SR-1079引物中的至少一種，分別對各所述基因組DNA進行PCR擴增；
[0010] SR-366-F: 5 ' -AACCAACTGAGCATTCTTGTGA-3 ' ；
[0011] SR-366-R: 5，-GCGCTAGGTTAAAGAGGACAAA-3，；
[0012] SR-495-F: 5 ' -CCAGGATTAGGTAGCTTAGTTCG-3 ' ；
[0013] SR-495-R: 5 ' -GCGATCTGAGGTTGACTCGT-3 ' ；
[0014] SR-1067-F: 5 ' -CGTCAACTAATGCTGTCCTGATG-3 ' ；
[0015] SR-1067-R:5,-TCGGATATGATGCTGCTAAAGGT-3,；
[0016] SR-1079-F: 5 ' -TACGACTGACGATTCCATTTCTC-3 ' ；
[0017] SR-1079-R:5'-AACTGGATTTCACAGGGAGTGTT-3' ；
[0018] (3)分別將步驟（2)獲得的各樣本PCR擴增產物進行6%尿素變性聚丙烯酰胺凝 膠電泳處理，得到所述待測食用向日葵雜交種SH363以及其親本標準向日葵種子A436和 R1843的電泳圖譜；
[0019] (4)對比上述雜交種SH363以及其親本標準種子A436和R1843的電泳圖譜，若所 述雜交種SH363同時具有其親本標準種子A436和R1843的特征譜帶，則判定所述待測食用 向日葵雜交種SH363為真實；反之，為假。
[0020] 所述待測食用向日葵雜交種SH363的品種純度按照公式所述雜交種SH363同時具 有其親本標準種子A436和R1843的特征譜帶的樣本種子數/檢測的樣本種子總數X 100% 計算得到所述待測食用向日葵雜交種SH363的品種純度。
[0021] 優選的，所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性和純度的方法，在所述 步驟（2)中，所述引物選自引物SR-366、引物SR-495、引物SR-1067和引物SR-1079中的任 意兩種。
[0022] 所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性和純度的方法，所述步驟（2)中， 所述PCR反應體系包括：
[0023] DNA 模板，30ng，1 μ L ;
[0024] 弓丨物，0· 2μΜ，1 μ L ;
[0025] 10 X EasyTap Buffer for PAGE (擴增緩沖液，含 Mg2+)，2mM，2· 5 μ L ;
[0026] dNTPs, 2. 5mM, 2 μ L ；
[0027] EasyTap DNA Polymerase for PAGE (Taq DNA 聚合酶），2. 5units，0· 5 μ L ;
[0028] ddH20,17μ L〇
[0029] 所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性和純度的方法，所述步驟（2)中， PCR擴增程序如下：95°C預變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s，之后每個 循環退火溫度下降0. 5 °C，直至54°C，94°C變性30s，54退火30s，72 °C延伸30s，進行30個 循環，最終72°C延伸20min，獲得的擴增產物4°C或_20°C保存，備用。
[0030] 所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性和純度的方法，所述步驟（3)中， 所述6%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠包括：
[0031] 尿素（Urea)，420g ;
[0032] 5XTBE, 100mL ；
[0033] 丙烯酰胺，57g;
[0034] Ν、Ν' -亞甲基雙丙烯酰胺，3g ;
[0035] ddH20 定容至 1L。
[0036] 所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性的方法，所述步驟（3)中包括如 下步驟：取步驟（2)獲得的PCR擴增產物加入10 μ L的lx上樣緩沖液（二甲苯菁0. 025g， 溴酚藍(λ 025g，(λ 5M/LEDTA2ml，去離子甲酰胺98ml)混合均勻，95°C變性5min，4°C冷卻，每 上樣孔加入上述混合液5 μ L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電泳lh，當溴酚藍移動到 距離膠板下沿約lcm時，停止電泳，取出膠板，用ddH 20沖洗干凈后，經3XGelSafe核酸染 料浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀，在波長為302nm紫外光激發下拍照。
[0037] 所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性的方法，所述步驟（1)中，所述食 用向日葵的基因組DNA的提取步驟具體包括：
[0038] a)取所述食用向日葵真葉10mg (約lcm2)置于裝有研磨珠 （D = 0· 6mm不銹鋼珠） 的2mL離心管中，置于液氮中預冷凍，并將預冷凍過的離心管置于研磨器中在30Hz條件下 研磨30s，隨后迅速轉移所述離心管于液氮中待用；
[0039] b)取出步驟a)的離心管并加入1000 μ L預熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和巰基乙醇構成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應50min，每lOmin取出所述離 心管上下顛倒混勻一次；
[0040] c)將步驟b)反應后的離心管放入4°C離心機中，于12000rpm下離心10min后，吸 取上清600-800 μ L并加入等體積的由體積比為1:1的三氯甲烷和Tris飽和酚構成的混合 液，震蕩混勻，放入4°C離心機中，于12000rpm離心15min后，吸取上清500 μ L至2mL離心 管中，備用；
[0041] d)向步驟c)中的所述離心管中加入等體積三氯甲烷混勻，靜置3min后，放入4°C 離心機，12000rpm離心10min，吸取上清300-400 μ L至1. 5mL離心管中，備用；
[0042] e)向步驟d)中的所述離心管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離心機，7500rpm離心7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入lmL質量濃度為75%的乙 醇，搖晃離心管，充分洗滌所述沉淀，然后放入4°C離心機，7500rpm離心7min，棄去上清液， 晾干沉淀；
[0043] f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 μ L的無菌ddH20溶解DNA，再加入 1 μ L的RNaseA，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得。
[0044] 所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性的方法，所述步驟（1)中還包括 將提取得到的基因組DNA模板進行定量檢測和/或質量檢測的步驟；
[0045] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 μ L用ddH20稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定0D26Q、0D2S。，并計算0D 26Q/0D2S。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質多不可用。
[0046] 所述質量檢測步驟具體包括：取5 μ L樣品DNA與等體積6XLoading Buffer混 合，并加入到含有體積比為萬分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣 孔中，180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，貝UDNA純且可用；若無帶出現，帶 型彌散，則表明DNA已降解不可用。
[0047] 本發明提供了一種由上述的方法在檢測及鑒定食用向日葵雜交種真實性和品種 純度領域的應用。
[0048] 本發明的上述技術方案相比現有技術具有以下優點：
[0049] (1)本發明所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性的方法，通過對大量 向日葵的SSR引物進行篩選研究，特定選擇引物SR-366、SR-495、SR-1067和SR-1079中的 一個或多個做為引物，對提取的食用向日葵雜交種SH363及其親本種植的向日葵的基因組 DN