快速檢測羊痘病毒的實時熒光rpa試劑盒、試紙條rpa試劑盒及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測羊痘病毒的試劑盒及其用途，特別涉及一種基于RPA反應的 用于快速檢測羊痘病毒的實時熒光RPA試劑盒以及試紙條RPA試劑盒，還涉及二者在快速檢 測羊痘病毒中的用途，本發明屬于預防獸醫學檢驗領域。
【背景技術】
[0002] 自PCR技術誕生以來已經有三十年了。從經典PCR、實時定量PCR再到現在的數字 PCR，這一技術在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。但是該技術需要特殊昂貴的熱循環儀器 以及熟練的操作人員，費時費力，難以用在現場診斷以及實驗條件差的地方。在發展中國家 實驗室中，由于PCR實施所需要的基礎設備和技術所限，大多數發展中國家仍然集中在使用 傳統的試驗方法，比如血清學方法、顯微鏡技術，或者培養以及鑒定傳染性以及非傳染性疾 病。為了填補傳統方法和PCR之間的空缺，新的等溫分子診斷技術正在開發，該方法尤其適 用于基礎設施、實驗設備以及試驗技術難于支持使用PCR進行診斷的地方。
[0003] 與常規方法相比較，等溫擴增實驗具有很高的敏感性和特異性，這些原因促使不 同的公司商業化不同的等溫擴增技術，比如，環介導的擴增(LAMP;Eiken，日本），RPA(RPA; Alere,USA and TwistDx,UK)，鏈置換擴增（strand displacement amplification，Becton Dickson, USA)。在這些技術中，LAMP是使用最為廣泛，且最成熟的試驗方法。與RPA方法相比 較，LAMP技術具有試驗設計比較麻煩(3對引物），特異性相對較弱（能擴增很多條帶），時間 仍然相對較長，以及易于污染等不足的地方。
[0004] 英國TwistDx Inc公司開發的重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase 八11^|]^;!^1:;[011，1^^)被稱為是可以替代?0?的核酸檢測技術。以此為基礎的丁\/丨51八1叩? 核酸擴增產品能夠在15分鐘內，37 °C -42 °C之間進行核酸檢測。現在使用最多的、最為成熟 的為進行實時監控的體系（如TwistAmp_? exo試劑盒，real-time RPA)以及基于試紙條的 終點檢測（TwistAmp ⑧ nfo 試劑盒，Recombinase Polymerase Amplification Assay combined with lateral flow test，LFS RPA)0
[0005] 實時熒光RPA(real-time RPA)試驗需要能激發并檢測熒光基團的恒溫儀器，比如 酶標儀或實時檢測的熱循環儀。自開發以來，該技術已經被廣泛的應用到人類疾病、獸醫藥 物、食品工業以及農業中，比如用于土拉弗朗西斯菌、細螺旋體、HIV-1DNA、鼠疫桿菌、炭疽 桿菌、天花病毒、B型鏈球菌、大腸桿菌產生的志賀毒素、中東呼吸綜合征冠狀病毒、裂谷熱 病毒、口蹄疫病毒、牛冠狀病毒、埃博拉病毒、蘇丹病毒、馬爾堡病毒、施馬倫貝格病毒、牛病 毒性腹瀉病毒、黃熱病毒以及戈登病毒等病原的檢測。
[0006] 對于試紙條RPA(LFS RPA)試驗而言，只要溫度能控制在37-42Γ之間就行，比如可 以在水浴鍋等設置中進行反應，或者直接用人的體溫進行加熱，隨后可以通過側流層析試 紙條LFS(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)讀取試驗結果。自開發以來，該 技術已經被廣泛的應用到人類疾病、獸醫藥物、食品工業以及農業中，比如用于感染性皮下 及造血組織壞死病毒（IHHNV)、惡性瘧原蟲、洋李痘皰病毒、羌蟲、力克次體、隱孢子蟲以及 黃熱病毒等的檢測。與常規方法相比較，該實驗具有很高的敏感性和特異性。
[0007] 羊痘又名羊"天花"，是由羊痘病毒引起的羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病。痘 病毒屬包括三種病毒，分別為綿羊痘病毒（sheeppox virus，SPPV)、山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV)以及牛瘰瘡皮膚病毒（lumpy skin disease virus，LSDV)。羊痘同時具有重大 的公共衛生意義，中國、瑞典以及印度都有人感染羊痘病毒的報道。發病羊的病癥是羊體無 毛或者少毛的皮膚部位發生丘疹和皰疹，并伴隨有動物的發熱。該病被世界動物衛生組織 列為A類傳染病，同時也被我國列為一類動物傳染病。不同的動物品種以及毒株可以導致不 同的致死率，致死率大概為10 % -75 %之間，妊娠母羊極其容易發生流產的現象。羊痘病毒 感染的羊群生產力嚴重降低，毛皮品質也嚴重受到影響，造成極大的經濟損失，大大影響羊 以及皮毛的國際貿易。痘病毒具有很強的宿主特異性，在自然條件下一般不會發生交叉感 染的現象。其中，綿羊痘病毒和山羊痘病毒呈現出世界性分布的特性，非洲、中東、北歐、地 中海地區均有該病的報道，中國的廣西、黑龍江、貴州等地也有該病爆發的報道。因此，建立 一種快速、簡單、特異、敏感的檢測方法來檢測羊痘病毒對于該病的防控起著關鍵的作用。
[0008] C.A.Balinsky等（Balinsky，C.A.，et al.,Rapid preclinical detection of sheeppox virus by a real-time PCR assay.J Clin Microbiol,2008.46(2):p.438-42.)公開了一種特異性的檢測綿羊痘病毒，并同時檢測山羊痘病毒和牛疙瘩皮膚病病毒的 real-time PCR檢測法。該方法的缺點在于需要復雜的試驗設備以及熟練的操作人員，該方 法需要較長的試驗時間（大約1.5h)。
[0009] Murray等（Murray，L·，et al.,Detection of capripoxvirus DNA using a novel loop-mediated isothermal amplification assay.BMC Vet Res,2013.9:p.90.) 公開了一種快速檢測痘病毒的新型環介導等溫擴增法，該方法能同時檢測綿羊痘病毒、山 羊痘病毒和疙瘩皮膚病病毒。通過LAMP的擴增結果表明，該方法能夠出現很多擴增條帶，因 此該方法同樣存在非特異性擴增，而且該方法需要設計三對引物來進行擴增，因此增加了 實驗設計的難度，并且增加了其與其他檢測平臺相結合的難度。并且檢測溫度較高(65°C)， 檢測時間較長(60min)。并且需要核酸電泳對擴增產物進行檢測，增加了污染的可能性。
[0010] 本發明針對羊痘病毒的GPCR基因，建立并評估了基于熒光探針的RPA(real-time RPA)檢測試劑盒以及基于試紙條的LFS RPA檢測試劑盒以實現快速檢測羊痘病毒的目的， 據我們所知，國內外尚無建立這樣的試劑盒用于檢測羊痘病毒。
【發明內容】
[0011] 本發明所要解決的技術問題是提供一種能快速、簡單、特異的鑒定羊痘病毒的檢 測方法及試劑盒。
[0012] 為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：
[0013] 本發明發明人針對羊痘病毒的GPCR基因設計引物和探針。同時通過對來自于 GenBank 中的 X74443，L39878，EU267274，EU267273，AJ849636，FJ905304，AY560591 和 AJ563705的GPCR基因同源序列進行比對分析，進一步確定了羊痘病毒GPCR基因的保守區 域，針對該區域設計引物和探針，以期能夠檢測到盡可能多的羊痘病毒。所有的引物和探針 都由生工生物(上海，中國）合成。本發明分別設計合成了三對上游引物和三對下游引物，通 過對引物與探針組合進行擴增效果評價，最終將其中一對能夠產生最強的擴增信號的引物 對與探針組合應用到本發明中。針對實時熒光RPA(real-time RPA)與試紙條RPA(LFS RPA， Recombinase Polymerase Amplification Assay combined with lateral flow test)的 不同檢測特點，本發明分別設計了用于實時熒光RPA以及試紙條RPA檢測的引物和探針序 列，該兩種試劑盒針對同一靶標序列，但引物和探針的修飾堿基和檢測平臺不同。
[0014]本發明一種用于快速檢測羊痘病毒的實時焚光RPA(real-time RPA)檢測試劑盒， 包括有一對引物和一條探針，
[0015]其中，所述的一對引物和一條探針的序列如下所示：
[0016] 上游引物：5'-CGTGTTGGTGTTTCCTTTTAATTTATACAATAGTA-3'（SEQ ID N0.1 所示）
[0017] 下游引物：5'-CAATAGCATGTCATTTATAACATTGATGAGTATTG-3'（SEQIDN0·2所示）
[0018] 探針：5 ' -TAAACAATGGAGTTTGGGAGATTGTTTGTG(FAM-
[0019] dT)A(THF)A(BHQl-dT)TCAAAGCTATGTTTTAC-P-3'（SEQ ID 從).3所示）。
[0020] 其中，BHQl-dT表示攜帶有熒光淬滅基團BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氫呋 喃連接子，FAM-dT表示攜帶有熒光素基團的胸腺嘧啶核苷酸，P表示磷酸，用于阻止鏈的延 伸。
[0021] 在本發明所述的實時熒光RPA檢測試劑盒中，優選的，所述試劑盒中還包括水解緩 沖液，醋酸鎂以及ddH20。
[0022] 使用本發明所述的實時熒光RPA檢測試劑盒檢測羊痘病毒，優選的，反應體系如 下：反應體系如下：14.7 5yL的水解緩沖液，1.0 5yL的1 ΟμΜ上游引物，1.0 5yL的1 ΟμΜ下游引 物，0.3yL的10μΜ探針，2yL的病毒DNA模板，4.6yL的ddH20以及1.25yL的280mM醋酸鎂；
[0023] 擴增反應在溫度設定為37-39 °C的實時熒光定量PCR儀中進行，反應時間為20min_ lh，結束后通過Mx3005P軟件對結果進行分析。
[0024] 更優選的，擴增反應在溫度設定為