一種多種淋巴細胞亞群的擴增方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學工程技術領域，具體地說涉及一種高效同時擴增多種淋巴細 胞亞群的方法及制備得到的細胞擴增試劑盒。
【背景技術】
[0002] 過繼性免疫治療是一種近期在治療實體瘤和血液癌癥臨床試驗中取得良好效果 的治療方法，并且成為了發展迅速的醫學研究領域。過繼性免疫治療的方法包括分離免疫 細胞，離體細胞擴增，及擴增后的免疫細胞回輸入癌癥患者。過繼性免疫療法成功根除癌癥 的例子包括應用腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、T細胞受體(TCR)修飾的T細胞和嵌合抗原受體 (CAR)修飾的Τ細胞。這些免疫細胞主要為αβΤ細胞。表達α和β鏈組成Τ細胞受體。除了αβΤ細 胞外，許多其他類型的免疫細胞，例如細胞因子誘導殺傷(CIK)細胞、CD3CD56雙陽性ΝΚΤ細 胞、CD3陰性CD56陽性的ΝΚ細胞和γ δΤ淋巴細胞，也可用于癌癥的過繼免疫治療。
[0003] 上述細胞中，CIK細胞是一種體外用IFN γ、IL-2和抗⑶3抗體刺激3至4周生成的淋 巴細胞，是一種新型的免疫活性細胞。首先加入IFNy是CIK細胞擴增的關鍵一步，IFNy可 活化存在于PBMC中的單核細胞，提供接觸依賴性因子⑶58/LFA-3和IL-12，這些因子有利于 獲得的最終生成的淋巴細胞的Thl細胞表型和CIK細胞的細胞毒力。IFN-γ可直接抑制Th2 細胞的增殖，從而抑制CD4+細胞的生成，有利于CD8+和TH1細胞的生成。抗CD3抗體，如0KT3， 提供一個初始的有絲分裂信號，然后由IL-2作為一種強有力的T細胞有絲分裂原持續刺激T 細胞增殖和生長，在3至4周的刺激后，免疫細胞總數可擴增數百倍，甚至上千倍。
[0004] 擴增后產生的CIK細胞含有多種淋巴細胞亞群。大部分為⑶3+⑶4+T淋巴細胞和 ⑶3+⑶8+T淋巴細胞。雖然⑶3+⑶56+NKT淋巴細胞和⑶3-/⑶56+NK細胞只占一小部分，這些 免疫細胞，特別是NKT細胞，具有直接的腫瘤細胞殺傷作用。這些細胞表達天然殺傷細胞受 體NKG2D(CD314)，可以非MHC限制性的方式溶解腫瘤細胞，用CIK細胞進行臨床實體瘤過繼 免疫治療呈現了很高的安全性。
[0005] 絕大多數T淋巴細胞屬于αβΤ細胞，它們的T細胞受體由α和β鏈組成，一小部分T淋 巴細胞表達Τ細胞受體gamma和delta異二聚體（γ δ)鏈。αβΤ細胞的激活需要通過抗原加工 和抗原提呈細胞呈現的MHC限制肽。與αβΤ細胞不同，γ δΤ細胞通過γ δΤΟ?直接識別腫瘤抗 原，對微生物病原體和腫瘤具有強大的非MHC-限制性溶解活性，所以γ δΤ細胞在腫瘤和感 染的免疫監視方面起到重要作用。在人體血液中，γ ST細胞占 Τ淋巴細胞總數的2-10%，為 了有足夠量的γ st細胞進行過繼細胞免疫治療，病人往往需要經過大容量白細胞單采術來 收集大量外周血單核細胞，單采術技術可收集1 X 1〇~9個外周血單核細胞，生產幾十億的γ ST細胞用于多次注射，ΙΡΡ(異戊烯焦磷酸)是人類γ δΤ細胞的天然抗原，已用于γ δΤ細胞的 擴增，異戊烯焦磷酸的合成類似物溴醇焦磷酸(BrHPP)及雙膦酸鹽唑來膦酸(Zometa)也可 以選擇性地激活擴增γ δΤ細胞。
[0006] 現有技術中，臨床試驗廣泛采用單獨使用某一種免疫細胞成分進行癌癥治療，多 種免疫細胞亞群同時應用一起攻擊一個腫瘤中的不同的目標的方式在臨床上還沒有得到 很好地探索。理論上，同時使用多種免疫細胞亞群的方法能通過攻擊多個不同的腫瘤目標 擴大免疫反應的范圍，可能會提供癌癥治療的協同作用。在這個方面，廣泛研究已證實γδτ 細胞對多種免疫反應的獨特和重要的貢獻。γ st細胞和其他免疫細胞之間的相互作用已經 被證實在這些免疫反應中發揮核心作用。
[0007] 在臨床應用上，腫瘤過繼性細胞免疫治療可能需要高達10~11免疫細胞，所以開發 有效的大規模的免疫細胞擴增的方法是過繼性免疫治療成功的一個關鍵。一種稱作"快速 擴增程序(REP)〃的方法已用于αβτ細胞的體外大量擴增。快速擴增程序是一種非特異性(抗 原非依賴性）的免疫細胞擴增方案，該方案采用過量的致死劑量伽瑪輻照異體外周血單個 核細胞（PBMC)作為飼養層細胞，同時使用抗CD3抗體（0ΚΤ3)和外源重組人白細胞介素 (rhIL)-2。這種快速擴增程序可以致使Τ淋巴細胞在14天內擴增1000倍。
[0008] 雖然上述快速擴增程序是一種常用的方法，但它的應用受到材料和技術上的限 制。在臨床應用快速擴增程序時，一個T細胞中通常會用200個外周血單核細胞來刺激。所以 快速擴增程序需要用血細胞分離機大容量白細胞單采術從多個健康的捐助者收集大量異 體外周血單核細胞。快速擴增方案中所收集的外周血單核細胞來自異體，需要經過大量的 實驗室檢測，以確認處于無菌狀態，這可能既昂貴又費時。并且，由于外周血單核細胞來自 于多個捐助者，收集而來的外周血單個核細胞對T細胞擴增的維持作用在捐助者個體間可 能會表現出很大的差異性，所有這些問題都會對大型多中心隨機臨床試驗有所妨礙。
【發明內容】
[0009] 為此，本發明所要解決的技術問題在于現有，現有擴增免疫細胞的方法昂貴費時、 且外周血單核細胞來自于多個捐助者，對T細胞的維持作用差異性較大，從而提出一種體外 刺激外周血高效同時擴增多種淋巴細胞亞群的方法及制備得到的細胞擴增試劑盒。
[0010] 為解決上述技術問題，本發明的技術方案為：
[0011] 本發明提供一種多種淋巴細胞亞群的擴增方法，其包括如下步驟：
[0012] S1、在腫瘤病人血液中收集的PBMC的培養基中加入IFNy和唑來膦酸，培養后再加 入0KT3抗體和重組人白細胞介素-2，刺激所述PBMC，完成淋巴免疫細胞初步擴增;所述腫瘤 包括血液系統腫瘤和實體瘤細胞。S2、初步擴增完成后，淋巴免疫細胞與飼養層細胞混合， 并加入唑來膦酸、0KT3抗體和重組人白細胞介素-2后繼續擴增。
[0013] 作為優選，所述飼養層細胞為正常人PBMC、人類紅白血病細胞株K562或人成纖維 細胞中的一種，所述飼養層細胞與淋巴免疫細胞的混合比例為1:1-300:1。
[0014] 作為優選，所述飼養層細胞與淋巴免疫細胞的混合比例為50:1-200:1。
[0015] 作為優選，所述步驟S1中所述培養基中同時加入IL-15和IL-18。
[0016]作為優選，所述正常人PBMC、所述人類紅白血病細胞株K562和所述人成纖維細胞 在使用前經100G的γ輻照或使用絲裂霉素 C處理。
[0017] 作為優選，所述人類紅白血病細胞株Κ562細胞為經過基因工程改造過的人類紅白 血病細胞株Κ562細胞，所述基因工程改造過的人類紅白血病細胞株Κ562細胞為經過遺傳修 飾的Κ562細胞，其可穩定表達⑶64高親和力Fc受體基因，共刺激分子⑶86和分子⑶137L基 因。
[0018]作為優選，所述正常人PBMC是從身體健康，無腫瘤病史的捐獻者的血液中收集的； 所述人成纖維細胞為人誘導多能干細胞分化成的人成纖維樣細胞。
[0019] 作為優選，所述步驟S1中，所述IFNy濃度為500-1500IU/ml，所述唑來膦酸濃度為 2-10μΜ，所述0KT3抗體濃度為20-100ng/ml，所述重組人白細胞介素-2的濃度為100-600IU/ mL〇
[0020] 作為優選，所述IL-15的濃度為10ng/ml，所述IL-18的濃度為10ng/ml。
[0021] 本發明還提供了所述的多種淋巴細胞亞群的擴增方法在癌癥的過繼性免疫治療 中的應用。
[0022] 本發明的上述技術方案相比現有技術具有以下優點：
[0023] (1)本法明提供的多種淋巴細胞亞群的擴增方法，初步擴增完成后，免疫細胞總數 在這段時間可擴增約10到40倍，其中γ δτ細胞擴增可達600倍，⑶3⑶56雙陽性NKT細胞擴增 約200倍，通常50%擴增后的細胞為γδΤ細胞，