一種雨生紅球藻硒蛋白及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種生物工程領域，特別是一種雨生紅球藻砸蛋白及其編碼蛋白與應 用。
【背景技術】
[0002] 砸是一種人體必需的微量營養元素，參與許多重要的細胞活動，砸元素被認為與 動物發育、免疫功能、抑制病毒等有密切關系，缺砸將導致一系列重要的生理過程失調，引 起屯、臟病、神經肌肉失調、癌癥與炎癥W及不育。中國大陸大部分地區是低砸帶，如果人體 砸含量長期低于o.lmg/kg，就會導致肝壞死、冠屯、病、屯、肌損壞、擴張性屯、肌炎、大骨關節 病、克山病、溶血性貧血、肝癌、胃癌、結腸癌及膜腺癌等疾病。相對于過量的無機砸對生物 體具有一定毒性，在我國補砸提倡采用安全性更高的有機砸強化劑。
[0003] 在有機砸中，砸蛋白是具有活性的氨基酸，其具有一個W上砸代半脫氨酸（Sec)。 砸元素滲入半脫氨酸后，成為活性中屯、。在蛋白質轉錄翻譯中，UGA通常作為終止密碼子，而 在砸蛋白中，由于有SBP2、SECIS、EFSec等結構的存在，使得Sec-tRNA能將UGA密碼子編碼成 Sec從而翻譯成砸蛋白。
[0004] 在漫長的進化歷史中，植物、真菌和部分昆蟲中丟失了砸蛋白，而低等藻類、動物 保留了砸蛋白組，表明砸蛋白具有的重要生理功能，在強大的選擇壓力下仍然保留下來。 L. Adam等2014研究表明，Sec突變成無砸的半脫氨酸之后，砸蛋白TR1的催化活性大幅降低。 而且在砸蛋白中，硫氧還蛋白還原酶(TR)是一種關鍵砸酶，作為位于細胞核或者細胞質的 胞漿酶，對維護免疫細胞氧化還原尤為重要。TR與硫氧還蛋白形成正常細胞中主要的二硫 化物還原體系，調節活性氧水平，調整細胞氧化還原功能，與細胞的生長、信號轉導及表型 有著密切的聯系。
【發明內容】
[0005] 首先，本發明提供一種雨生紅球藻砸蛋白，雨生紅球藻砸蛋白一硫氧還蛋白還原 酶(Thioredoxin reductase,HpTRl)，來源自雨生紅球藻SAG 192.80,所述的雨生紅球藻砸 蛋白具有的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID No:2所示，或是將SEQ ID No:2的氨基酸殘 基序列的一個或幾個(不超過10個)氨基酸殘基取代和/或缺失和/或添加，且與上述蛋白具 有相同活性的經SEQ ID No:2衍生的氨基酸殘基序列。
[0006] 其次，本發明提供雨生紅球藻砸蛋白的編碼基因，其cDNA基因選自下述核巧酸序 列之一或幾種：
[0007] (1)序列表中沈910齡：1的0臟序列；
[000引（2)編碼序列表中SEQ ID No:2蛋白質序列的核巧酸片段；
[0009] (3)在高嚴謹條件下能與序列表中SEQ ID No: 1限定的DNA序列雜交的核巧酸序 列，即在短時間內（幾小時）、低鹽、高溫條件下進行雜交，避免錯配可能性；
[0010] (4)同序列表中SEQ ID No:l限定的DNA序列有90%W上同源性且編碼相同功能蛋 白質的DM序列。
[0011] 進一步的，所述基因序列的開放閱讀框是SEQ ID No:3自5'端第25位至1632位堿 基。
[0012] 含有上述的砸蛋白編碼基因序列的表達載體、轉基因細胞系或宿主菌屬于本專利 的保護范圍。
[0013] 再次，本發明提供一種提高雨生紅球藻砸蛋白含量的方法，所述方法是將砸蛋白 編碼基因轉入植物中，所述的砸蛋白編碼基因來自下列核巧酸之一或幾種：
[0014] (1)序列表中沈910齡：1的0臟序列，或
[001引（2)編碼序列表中SEQ ID No:2蛋白質序列的核巧酸片段，或
[0016] (3)在高嚴謹條件下能與序列表中SEQ ID No: 1限定的DNA序列雜交的核巧酸序 列，或
[0017] (4)同序列表中SEQ ID No:l限定的DNA序列有90%w上同源性且編碼相同功能蛋 白質的DNA序列。
[0018] 最后，本發明中砸蛋白編碼基因在提高植物砸蛋白含量上的應用也屬于本發明保 護的范疇，如轉入雨生紅球藻。
[0019] 本發明的有益效果在于，提供一種安全性更高的有機砸蛋白，W及編碼基因。
【附圖說明】
[0020] 圖1是雨生紅球藻TR1砸蛋白基因全長序列及保守的SECIS結構。
[0021] 圖2是氨基酸序列與其它物種TR1氨基酸序列的多重比對結果。
[0022] 圖3是雨生紅球藻mRNA水平表達差異。
[0023] 圖4是雨生紅球藻經13mg/L亞砸酸鋼處理組與對照組的TR1砸酶活性差異。
【具體實施方式】
[0024] 下述實施例中的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0025] 實施例1雨生紅球藻硫氧還蛋白還原酶基因的獲得
[00%] 將雨生紅球藻在ESP培養基中靜止培養，培養基的組成如下:NaM)3 0.2g/L，K2HP化 0.02g/L，MgS〇4.7此0 0.02邑/1，±壤提取液30血/L，EDTA 0.004g/L，FeS〇4.7此0 0.0035g/ L，ZnS04.7H20 5X 10-6g/L，MnS04.4H20 1X10-5g/L，出B03 5 X 10-5g/L，CuS04.5此0 2.5X l〇-8g/L，Co(N〇3)2.細2〇 5Xl〇-6g/L，脈蛋白腺lg/L，pH調至7-8.5范圍內。培養溫度為22± 〇.5°C，光強 20 皿 olm-2s-i，培養 15 天。
[0027] 其中，±壤提取液配置方法如下：在Ξ角瓶中加入體積天然腐殖上，應避免含 有化肥及農藥，也應避免含有過量黏±，加入去離子水至超過±壤表面5厘米，24小時間隔 內高壓蒸汽滅菌1小時兩次，高速離屯、分離沉積物，輕輕倒出上清液至保存容器，121°C高壓 滅菌20分鐘后保存于冰箱。
[0028] 硫氧還蛋白還原酶TR1基因克隆與富集驗證：
[0029] 利用SMARTe瞄PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒(Clontech，美國）采用cDNA末 端快速擴增(RACE)技術從雨生紅球藻中擴增其硫氧還蛋白還原酶TR1 cDNA，所用引物如表 1所示，經5'一RACE和3'一RACE擴增之后組裝完成全長的雨生紅球藻TR1全長cDNA(如沈Q ID No :3所示），其結構如圖1所示，其中，圖1-A為DNA序列及對應的氨基酸序列，*號標注的 是砸代半脫氨酸密碼子位點。開放閱讀框內高亮區域為NADP綁定蛋白、化晚核巧酸二硫酸 氧化還原酶及二聚體化功能域等基序。3'一UTR區粗體顯示的是SECIS元件。圖1-B為SECIS 元件的二級結構，具有標志性的頂環和AG/GA四重奏等保守結構。
[0030] 表1雨生紅球藻TR1 cDNA克隆、測序及實時巧光定量PCR所用引物序列。
[0031]
[0032]
[0033] 通過序列比對發現，紅球藻TRl基因雨生紅球藻與人類TRl基因的一致性達到 69%，具有顯著的砸蛋白基因結構，如圖2所示，根據雨生紅球藻TR1基因開放閱讀框推斷的 砸蛋白氨基酸序列與其它物種TR1氨基酸序列的多重比對結果，包括人(NP_877393)、鼠 (NP001035988)、雞(NP_001025933)、斑馬魚(NP_001025933)、萊茵衣藻(XP_001696072)、球 石藻(BAH20464)、團藻(XP002948633)、褐潮藻(XP_009037)、線蟲(AAD41826)。黑色陰影標 示完全一致序列，灰色陰影標示保守替代序列，高度保守的GGTCVNVGCIP和GCUG由框標注， 其中砸代半脫氨酸由*號標注。其編碼區倒數第二位與其它物種TR1砸蛋白基因一致，是由 TGA編碼砸代半脫氨酸化)的位點，且核屯、功能區具有完全保守的GGTCVNVGCIP與GCUG序列。
[0034] 實施例甜pTRl基因表達的巧光定量分析
[0035] 根據雨生紅球藻TR1基因序列設計qRT-PCR引物(表1)，利用巧光定量PCR技術，對 處理組與對照組的樣品進行分析，mRNA水平表達差異結果如圖3所示:對處于指數生長期的 藻細胞(密度約為每毫升3X105個細胞）用13mg/L亞砸酸鋼處理，其結果顯示:TR1的轉錄水 平在第6小時達到最高峰，達到初始表達水平的兩倍W上。而未加砸的對照組的TR1轉錄水 平無顯著差異。
[0036] 實施例抓pTRl基因的酶活性檢測
[0037] 為進一步確認砸蛋白富集效果，利用硫氧還蛋白還原酶活性檢測試劑盒K763 (Biovision，美國）對蛋白活性進行分析。該試劑盒檢測原理是通過DTNB還原法分別對含有 TR特異性抑制劑與不含抑制劑的對照組進行兩次檢測，其差值即為TR在NADPH存在的情況 下催化的DTNB的還原量，計算催化產生的TNB在412皿的比色值可W得到TR活性。雨生紅球 藻經13mg/L亞砸酸鋼處理的結果如圖4所示：在加砸處理組中，第Ξ小時TR活性有顯著上 升，到第六小時達到峰值，接近初始值的2倍，而第十二小時后衰減到1.5倍，之后TR活性與 初始值無顯著差異。相比加砸實驗組，對照組各時間段TR活性并無顯著差異。
【主權項】
1. 一種雨生紅球藻硒蛋白，其特征在于，氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID N〇:2所示 或是將SEQ ID No:2的氨基酸殘基序列的一個或幾個氨基酸殘基取代和/或缺失和/或添 加，且與上述蛋白具有相同活性的經SEQ ID N〇:2衍生的氨基酸殘基序列。2. 如權利要求1所述的一種雨生紅球藻硒蛋白，其特征在于，差異的氨基酸序列殘基不 超過10個。3. 權利要求1所述的雨生紅球藻硒蛋白的編碼基因，其特征在于，來自下列核苷酸： (1) 序列表中SEQIDNo:l的DNA序列，或 (2) 編碼序列表中SEQ ID N〇:2蛋白質序列的核苷酸片段，或 (3) 在高嚴謹條件下能與序列表中SEQ ID No: 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列，或 (4) 同序列表中SEQ ID No: 1限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質 的DNA序列。4. 含有權利要求3所述的硒蛋白編碼基因序列的表達載體、轉基因細胞系或宿主菌。5. -種提高雨生紅球藻硒蛋白含量的方法，其特征在于，所述方法是將權利要求3的硒 蛋白編碼基因轉入植物中。6. 如權利要求3所述的硒蛋白編碼基因在提高植物硒蛋白含量上的應用。
【專利摘要】一種雨生紅球藻硒蛋白及其編碼基因與應用,本發明涉及一種生物工程領域，為提供有機硒，本發明提供一種硒蛋白，所述的硒蛋白含有氨基酸殘基序列如序列表中SEQ？ID？No:2所示或是將SEQ？ID？No：2的氨基酸殘基序列的一個或幾個氨基酸殘基取代和/或缺失和/或添加，且與上述蛋白具有相同活性的經SEQ？ID？No：2衍生的氨基酸殘基序列。本發明的有益效果在于，提供一種安全性更高的有機硒蛋白，以及編碼基因。
【IPC分類】C12N15/53, C12N9/02
【公開號】CN105671012
【申請號】CN201610230657
【發明人】胡章立, 鄭怡鴻, 李澤, 陶明, 賈彬
【申請人】深圳大學
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年4月13日