一株藍莓專用的根際促生阿氏芽孢桿菌及其應用
【專利摘要】本發明公開了一株藍莓專用的根際促生阿氏芽孢桿菌及其應用，該菌株分類命名為阿氏芽孢桿菌<i>Bacillus aryabhattai</i>，編號為BPR078，已于2016年1月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.11971。本發明的藍莓根際促生阿氏芽孢桿菌制成菌劑后接種到藍莓扦插苗，可明顯加速藍莓生根，促進扦插苗生長，與對照相比，差異達到顯著水平。因此，本發明為將來開發藍莓專用的微生物肥料提供了優良的菌株資源。CGMCC No.1197120160107
【專利說明】
一株藍莓專用的根際促生阿氏芽孢桿菌及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一株藍莓專用的根際促生阿氏芽孢桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 藍莓(Vacciniumssp.L.)果實顏色艷麗，風味獨特，含有大量的蛋白質、脂肪、維生 素、果膠物質、S0D、黃酮、鉀、磷、鈣等豐富的營養成分;含有大量的天然色素，且經研究發現 在多種水果中，其色素含量最高，已成為保健藥物的原料。
[0003] 植物根際促生細菌是指生存在植物根圈范圍中，對植物生長有促進或對病原菌有 拮抗作用的有益細菌統稱，對植物生長及病害防治有極其重要的作用。據不完全統計，已發 現包括假單胞菌和芽抱桿菌等20多個屬的植物根際促生細菌具有防病促生潛能的報道。植 物根際促生細菌可分泌植物促生物質，包括植物激素、維生素、氨基酸和其它活性有機小分 子及衍生物等;還可改善植物根際的營養環境，有效控制植物病害等。
[0004] 本發明人已從藍莓根際土壤中篩選出了藍莓根際促生紡錘芽孢桿菌L13(保藏編 號為CGMCC No.7068)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)L5(保藏編號為CGMCC No.7667)， 能適應藍莓特定的根際土壤環境，并能促進藍莓生長。
[0005] 藍莓為淺根系，無根毛，根系多分布于淺層土壤中，生長環境較為特殊，常用的功 能微生物接種到藍莓土壤中，難以存活和定殖，無法產生持續、穩定的功效，基于以上原因， 適宜藍莓的PGPR菌株資源十分匱乏，繼續豐富藍莓菌株資源，對改善藍莓根系的微生態環 境、促進藍莓生長、改善藍莓品質具有重要意義。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一株藍莓專用的根際促生阿氏芽孢桿菌及其應用，該菌株能 適應藍莓特定的根際土壤環境，并能促進藍莓生長。
[0007] 本發明采用以下技術方案：
[0008] 本發明的第一個目的是提供一株阿氏芽孢桿菌，該菌株的分類命名為阿氏芽孢桿 菌Bacillus aryabhattai，編號為BPR078,已于2016年1月7日保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學 院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No. 11971。
[0009] 菌落特征及菌體形態：
[0010]在LB培養基上菌落形態為圓形規則，且菌落較大，培養24h菌落大小約為2-4.5mm， 表面凸起，較濕潤，微黃色，不透明，鏡檢菌體較大，桿狀，有芽孢。
[0011] 生理生化特征：
[0012] 檸檬酸鹽（西蒙氏）試驗陽性，脲酶試驗陽性，棉籽糖試驗陽性，L-鼠李糖試驗陰 性，氧化酶(Ko vacs)試驗陰性，伏-普試驗陰性，甲基紅試驗陰性，吲哚試驗陰性，0NPG試驗 陽性，賴氨酸脫羧酶試驗陰性，鳥氨酸脫羧酶試驗陰性，衛矛醇試驗陰性。
[0013] 功能定性及定量測定：
[0014]本發明的菌株能夠產蛋白酶，于干酪素培養基中培養48h產生透明圈直徑D為 16mm，菌落直徑d為6.1mm，D/d為2.62，定量測定發酵液中蛋白酶酶活為52.895μg/ml。
[0015]利用美國Waters高效液相色譜儀515型，Waters2487雙波長紫外檢測器測定發酵 液有機酸種類及含量。色譜條件為色譜柱：美國Thermo Hypersil GOLD aQ 250X4.6mm， 5u;流動相：10mmoLNH4H2P〇4(磷酸調pH=2.3):甲醇= 98:2(V:V);檢測波長:210nm，靈敏度： 0.5AUFS，進樣量：lOuL，流速:0.8mL/min，柱溫：28°C。檢測結果顯示，BPR078產草酸濃度為 452.36μg/ml，產乙酸濃度為9542μg/ml，產檸檬酸濃度為3865μg/ml。
[0016] 本發明的第二個目的是提供一種微生物混合物，其特點是至少包含本發明的菌 株，所述微生物混合物可以包含其他具有促進植物生長(特別是促進藍莓生長)并與本發明 的菌株共生的微生物。
[0017] 本發明的第三個目的是提供一種包含本發明菌株或本發明微生物混合物的產品， 該產品可以是菌劑或組合物等形式。
[0018] 優選的，所述產品包括載體;所述載體可以為固體載體或液體載體。所述固體載體 或液體載體均為常規的載體材料，其中，固體載體可以選自粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白 碳、沸石、硅石、玉米粉、豆粉、聚乙烯醇和/或聚二醇;液體載體可以為植物油、礦物油或水。
[0019] 優選的，所述產品為粉末形式、溶液形式、懸浮劑形式、片劑形式、顆粒形式或其他 形式。
[0020] 進一步優選的，所述粉末形式可以為凍干粉末形式;所述片劑形式為含有所述凍 干粉末和任選營養素(例如維生素、礦物鹽等)的片劑形式。
[0021 ] 所述產品的活性成分為阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)BPR078，該活性成 分可以以被培養的活細胞、活細胞的發酵液、細胞培養物的濾液或細胞與濾液的混合物的 形式存在。
[0022] 本發明的第四個目的是保護本發明的阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai) BPR078發酵液。
[0023] 本發明的第五個目的是提供一種本發明的菌株、本發明的微生物混合物或者本發 明的包含本發明菌株或本發明微生物混合物的產品在促進植物生長中的應用，所述植物具 體為藍莓。
[0024]本發明的菌株可促進藍莓扦插苗生根，促進藍莓生長，并可提高藍莓根際土壤中 蛋白酶和蔗糖酶的活性。
[0025]本發明的第六個目的是提供一種促進藍莓生長的方法，該方法包括使需要生長的 藍莓的根際周圍環境與本發明的菌株-阿氏芽孢桿菌(Baci 1 lus aryabhattai)BPR078接觸 的步驟。
[0026]優選的，所述藍莓的根際周圍環境為藍莓根際土壤。
[0027] 優選的，使需要生長的藍莓的根際周圍環境與本發明的菌株-阿氏芽孢桿菌 (Baci 1 lus aryabhattai )BPR078接觸的步驟在于：用本發明的菌株-阿氏芽孢桿菌 (Bacillus aryabhattai)BPR078接種需要生長的藍莓根際土壤中。
[0028] 本發明的有益效果是:本發明的藍莓根際促生阿氏芽孢桿菌接種到藍莓扦插苗， 可明顯加速藍莓生根，促進扦插苗生長，并可提高藍莓根際土壤中蛋白酶和蔗糖酶的活性， 與對照相比，差異達到顯著水平。因此，本發明為將來開發藍莓專用的微生物肥料提供了優 良的菌株資源。
【附圖說明】
[0029] 圖1是本發明菌株的菌落形態圖。
[0030] 圖2是本發明菌株的光學顯微鏡鏡檢圖。
[0031] 圖3是采用本發明菌株的發酵液的藍莓組培苗和對照組的藍莓組培苗對比照片。
【具體實施方式】
[0032] 實施例1本發明阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)BPR078的篩選
[0033] (1)篩選過程
[0034]在青島膠南佳沃藍莓種植基地不同大棚內采集藍莓根際土壤樣品3個。通過梯度 稀釋法，從根際土樣中分離出細菌分離物。通過三區劃線法對分離到的細菌進行純化，并通 過鏡檢判斷菌株是否純化，對純化后的細菌進行編號，挑取單菌落，轉接到LB斜面上保存備 用。
[0035]向含有L-色氨酸的R2A液體培養基中接菌，28°C，180rpm，搖床培養4d。取50微升菌 懸液滴于白色陶瓷板上，同時加入50微升Salkowski比色液（50ml 35%HCL〇4+lmlO ? 5mol/L FeCl3)。將加入50mg/L IAA的比色液作為陽性對照。白色陶瓷板于室溫避光放置30min后觀 察，顏色變紅者表示能夠分泌IAA，初篩出分泌IAA的細菌。
[0036]對初篩獲得的分泌IAA的細菌進行定量測定，繼續篩選具有應用潛力的根際促生 細菌。最后通過藍莓的盆栽實驗，確定一株促進藍莓生長效果最好的細菌，編號為BPR078。 [0037] (2)菌落特征及菌體形態
[0038]如圖1和圖2所示，在LB培養基上菌落形態為圓形規則，且菌落較大，培養24h菌落 大小約為2-4.5mm，表面凸起，較濕潤，微黃色，不透明，鏡檢菌體較大，桿狀，有芽孢。
[0039] (3)生理生化特征
[0040]檸檬酸鹽（西蒙氏）試驗陽性，脲酶試驗陽性，棉籽糖試驗陽性，L-鼠李糖試驗陰 性，氧化酶(Ko vacs)試驗陰性，伏-普試驗陰性，甲基紅試驗陰性，吲哚試驗陰性，0NPG試驗 陽性，賴氨酸脫羧酶試驗陰性，鳥氨酸脫羧酶試驗陰性，衛矛醇試驗陰性。
[0041] (4)功能定性及定量測定
[0042]菌株能夠產蛋白酶，于干酪素培養基中培養48h產生透明圈直徑D為16mm，菌落直 徑d為6.1mm，D/d為2.62，定量測定發酵液中蛋白酶酶活為52.895μg/ml。
[0043]利用美國Waters高效液相色譜儀515型，Waters2487雙波長紫外檢測器測定發酵 液有機酸種類及含量。色譜條件為色譜柱：美國Thermo Hypersil GOLD aQ 250X4.6mm， 5u;流動相：10mmoLNH4H2P〇4(磷酸調pH=2.3):甲醇= 98:2(V:V);檢測波長:210nm，靈敏度： 0.5AUFS，進樣量：lOuL，流速:0.8mL/min，柱溫：28°C。檢測結果顯示，BPR078產草酸濃度為 452.36μg/ml，產乙酸濃度為9542μg/ml，產檸檬酸濃度為3865μg/ml。
[0044] (5)16S rDNA序列分析
[0045] 本發明菌株的16S rDNA基因序列，見核苷酸序列表所示。將所測16S rDNA序列與 GenBank數據庫中的序列比對。
[0046] BPR078系統發育樹中同阿氏芽抱桿菌(Bacillus aryabhattai)處于同一分枝，其 16S rDNA序列與阿氏芽孢桿菌(Baci 1 lus aryabhattai)的相似性達98 ? 77%。結合菌落形 態，生理生化特征和16SrDNA序列分析，將本發明的菌株BPR078鑒定為阿氏芽孢桿菌 (Bacillus aryabhattai)〇
[0047]實施例2對藍莓生長具有促生作用
[0048]將保存在斜面上的BPR078用三區劃線的方法活化在LB (蛋白胨10g; NaCl 10g;酵 母浸膏58;瓊脂15-2(^;水100〇1111$117.〇-7.2，分裝，121<€滅菌2〇111；[11)平板上。挑取單菌落 至相應的l0ml液體培養基中，37°C，180rpm培養24h。按1 %接種量將種子液接種至相應的 50ml液體培養基中進行發酵，37°C，180rpm培養2d安排藍莓組培苗的穴盤苗試驗。
[0049] 穴盤苗試驗于2015年4月30青島沃林藍莓生產基地進行，選用藍莓組培苗，，每個 穴盤為1個處理，扦插200棵組培苗。每個處理施加100mL促生菌發酵液，稀釋至1000mL均勻 澆灌，正常管理，2015年7月30取樣調查，結果如下表1~3和圖3所示。可以看出，接種BPR078 可促進藍莓扦插苗生根，促進藍莓生長，并可提高藍莓根際土壤中蛋白酶和蔗糖酶的活性。 由此可見，BPR078在藍莓栽培種具有很大的應用潛力。
[0050]表1營養缽苗試驗植株生長指標
[0052]表2營養缽苗試驗植株生物量
[0054]表3營養缽苗試驗土壤酶活測定
[0056] 實施例3
[0057] -種微生物混合物，其特點是包含本發明的菌株阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai )BPR078，還包含其他微生物，所述其他微生物為促進藍莓生長并與阿氏芽孢 桿菌(Bacillus aryabhattai)BPR078不產生詰抗作用的微生物。經過實驗驗證，該微生物 混合物明顯促進藍莓扦插苗生根，促進藍莓生長，并可提高藍莓根際土壤中蛋白酶和蔗糖 酶的活性。
[0058] 實施例4
[0059] -種包含本發明菌株或本發明微生物混合物的菌劑，菌劑中包括載體和該本發明 所述的菌株-阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)BPR078,所述載體可以為固體載體或 液體載體。所述固體載體或液體載體均為常規的載體材料，其中，固體載體可以選自粘土、 滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石、玉米粉、豆粉、聚乙烯醇和/或聚二醇;液體載體可 以為植物油、礦物油或水。菌劑的形式為凍干粉末形式。經過實驗驗證，該菌劑以阿氏芽孢 桿菌(Bacillus aryabhattai)BPR078為活性成分，可以促進藍莓扦插苗生根，促進藍莓生 長，并可提高藍莓根際土壤中蛋白酶和蔗糖酶的活性。
【主權項】
1. 一株阿氏芽孢桿菌，其特征是：該菌株分類命名為阿氏芽孢桿菌Bacillus aryabhattai，編號為BPR078，已于2016年1月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 11971。2. -種微生物混合物，其特征是:至少包含權利要求1所述的阿氏芽孢桿菌。3. 包含權利要求1所述的阿氏芽孢桿菌或權利要求2所述的微生物混合物的產品。4. 如權利要求3所述的產品，其特征是:所述產品為粉末形式、溶液形式、懸浮劑形式、 片劑形式、顆粒形式或其他形式。5. 包含權利要求1所述的阿氏芽孢桿菌的發酵液。6. 權利要求1所述的阿氏芽孢桿菌或權利要求2所述的微生物混合物或權利要求3所述 的產品或權利要求5所述的發酵液在促進植物生長中的應用。7. 如權利要求6所述的應用，其特征是:所述植物為藍莓。8. 如權利要求7所述的應用，其特征是:接種權利要求1所述的阿氏芽孢桿菌或權利要 求2所述的微生物混合物或權利要求3所述的產品或權利要求4所述的發酵液能提高藍莓根 際土壤中的蛋白酶和蔗糖酶的活性。9. 一種促進藍莓生長的方法，其特征是：該方法包括使需要生長的藍莓的根際周圍環 境與權利要求1所述的阿氏芽孢桿菌接觸的步驟。10. 如權利要求9所述的方法，其特征是，使需要生長的藍莓的根際周圍環境與權利要 求1所述的阿氏芽孢桿菌接觸的步驟在于:采用權利要求1所述的阿氏芽孢桿菌接種需要生 長的藍莓的根際土壤中。
【文檔編號】A01N63/02GK105820986SQ201610368365
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】杜秉海, 馬海林, 丁延芹, 劉方春, 姚良同, 杜振宇, 范玲超, 馬丙堯, 徐文鳳, 李麗
【申請人】山東省林業科學研究院