一種用于空腸彎曲菌快速分型的引物及方法
【專利摘要】本發明屬于微生物分子分型領域，尤其涉及一種用于空腸彎曲菌快速分型的引物及方法。本發明提供的用于空腸彎曲菌快速分型的引物，包括13對空腸彎曲菌引物。本發明提供的用于空腸彎曲菌快速分型的引物具有更好的分型能力和更高的分辨指數，可以對空腸彎曲菌進行更精確的分型。此外，本發明提供的用于空腸彎曲菌快速分型的方法具有操作簡便快捷、穩定性和可重復性好的優點，可以有效的輔助空腸彎曲菌感染疾病的臨床診斷，是一種較為理想的空腸彎曲菌分型方法。
【專利說明】
一種用于空腸彎曲菌快速分型的引物及方法
技術領域
[0001] 本發明屬于微生物分子分型領域，尤其涉及一種用于空腸彎曲菌快速分型的引物 及方法。
【背景技術】
[0002] 彎曲菌是一類重要的食源性人獸共患病原菌，可引起人和動物胃腸道感染，早在 1980年，世界衛生組織已將彎曲菌腸炎列為最常見的腸道傳染病之一，其中空腸彎曲菌 (Campylobacter jejuni)是彎曲菌感染中最常見的一個種，約占80-90%。
[0003] 近年來，空腸彎曲菌感染率在世界各地普遍呈上升趨勢。在歐美發達國家的感染 率為50-100/10萬，引起的腹瀉病例數甚至超過了沙門氏菌和志賀氏菌，居于第一位。此外， 空腸彎曲菌還可引發格林巴利綜合癥(Guillain-Barre symdrome，GBS)、急性神經肌肉癱 瘓和反應性關節炎等疾病。其中，GBS是空腸彎曲菌感染后最嚴重的并發癥，可導致呼吸肌 麻痹而死亡。空腸彎曲菌廣泛分布于自然界及家畜、家禽的腸道內，雖然該菌在食物中不容 易生長繁殖，但其感染所需劑量低，大約攝入400-500cfu便可引發腸道感染，這對畜禽食品 安全和人類健康造成了嚴重的威脅。因此，對空腸彎曲菌的檢測研究已成為當前研究的熱 點。
[0004] 中國專利申請201110276557.4公開了一種空腸彎曲桿菌PCR檢測試劑盒及其應 用，該試劑盒包括一對針對空腸彎曲桿菌馬尿酸酶(HipO)基因的保守區域設計的特異性引 物，對空腸彎曲桿菌具有較高的檢測靈敏度。中國專利申請201510573715.0公開了一種檢 測空腸彎曲菌的方法及其單抗，該方法是利用抗空腸彎曲菌的單克隆抗體與空腸彎曲菌特 異性結合，從而可以快速檢測出空腸彎曲菌。但是，上述方法僅可以檢測出空腸彎曲菌，無 法對空腸彎曲菌進行進一步的分型，無法滿足臨床診斷的需求。
[0005] 由于空腸彎曲菌的抗原結構較復雜，其抗原分型尚未完全確定，目前我國已報道 的空腸彎曲菌分離菌株共有57個血清型，其中人源菌株常見有10個血清型。隨著近年分子 生物學及相關技術的迅猛發展，使基于其基礎上的各種空腸彎曲菌基因分型方法不斷推 陳出新，并因其分辨力、分型率和敏感性高于表型分型方法而越來越受到人們的廣泛重視。 空腸彎曲菌的基因分型方法主要包括脈沖場凝膠電泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)、限制性片段長度多態性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、隨機擴增多態性DNA(Random amplified polymorphic DNAjRAFO) 等。PFGE方法分辨力高，重復性好，是目前所有分型方法中的金標準，但耗時長，費用高，且 需要特定的儀器設備。RFLP技術可以區分不同的基因型，但該方法分辨力不高，檢測周期相 對較長。RAPD技術使用一系列具有10個堿基左右的單鏈隨機引物，對全基因組DNA進行PCR 擴增，以檢測其多態性，該方法具有成本低，速度快、易于操作的優點，但重復性較差，影響 因素較多。
[0006] 擴增基因間片斷多態性(Amplified intergenic locus polymorphism，AILP)技 術作為一種最新的分子分型技術在2005年建立。AILP技術對細菌分型僅需知道該菌種的全 基因組或部分基因組序列，粗提DNA即可做為PCR擴增的模板，該技術操作簡便，在保證分型 結果具有較好的穩定性、可重復性和較高分辨率的同時可以大大節約時間與成本。但是，目 前，尚未見有AILP技術應用于空腸彎曲菌基因分型的報道。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種用于空腸彎曲菌快速分型的引物及方法，以彌補現有 空腸彎曲菌分型技術中的不足。
[0008] 本發明提供了一種用于空腸彎曲菌快速分型的引物，包括以下13對空腸彎曲菌引 物：
[0009] 針對mnmA基因的上游引物CJF1:5'-TTTCTCCGTAGTTGGGTCC-3'（SEQ ID N0.1)和下 游引物CJR1:5 '-GGTGCTTTGCCTTATCGTG-3 '（ SEQ ID NO · 2);針對trpC基因的上游引物CJF2: 5 '-AGGAACAAGCAAAGTAGGTGG-3 '（ SEQ ID NO · 3 )和下游弓丨物 C JR2 : 5'-AGCCATTCTAAGTCCAAAGC-3'（SEQ ID N0.4);針對 rpmH 基因的上游引物(：開3:5'_ TATCCCAAGATGGTAAAAGCA-3 '（ SEQ ID N0 · 5)和下 3'（SEQ ID N0.6);針對acs基因的上游引物CJF4:5'-TGCTACAGGCACAGGAAAA-3'（SEQ ID NO· 7)和下游引物CJR4:5 '-AAGCTGAGTCGCATAAGAAAA-3 '（SEQ ID NO · 8);針對ansA基因的上 游引物CJF5 : 5 ' -GGAAACAACCCAGACTACCA-3 '（ SEQ ID NO · 9)和下游引物(：幾5:5'-GACTAACCCTACGATGACGAG-3'（SEQ ID Ν0· 10);針對 ppk 基因的上游引物(：開6:5'_ TGAAGCAAGTATGGAAGGAGT-3 '（SEQ ID NO · 11)和下 3'（SEQIDN0·12);針對metB基因的上游引物CJF7:5'-GCGACATTATCTCCCGAACT-3'（SEQID NO · 13)和下游引物CJR7:5 ' -AGGCTTAGGCTTGAACTGC-3 '（ SEQ ID NO · 14);針對surE基因的上 游引物CJF8:5'-CTTGGTGGAGTGGGTGGAA-3'（SEQIDN0·15)和下游引物CJR8 :5'-CAGAAGTGGGAGATAARGTGA-3'（SEQ ID Ν0· 16);針對 rplT 基因的上游引物(：開9:5'-GTCATTCAAACTCCCCTCTG-3 '（SEQ ID NO · 17)和下游引物CJR9:5 ' -GCTGGAAAACTTGGTCGTG-3 ' (SEQIDN0·18);針對dnaB基因的上游引物CJF10:5'-AGGTGAAGAAATGGAAAGGG-3'（SEQID NO · 19)和下游引物CJR10:5 ' -GCCGCTGAAATACATAAAGAA-3 '（ SEQ ID NO · 20);針對arsR基因 的上游引物CJF11:5 ' -AGGGAACTTGGGCGTATTA-3 '（ SEQ ID NO · 21)和下游引物(：貝11:5'-CCATCGTTTGCTTTTGTATTT-3'（SEQ ID N0.22);針對 ksgA 基因的上游引物(：開12:5'-AGTGCAGGGGAGATAGTYG-3 '（SEQ ID NO · 23)和下 3 '（ SEQ ID NO · 24);針對tonB基因的上游引物CJF13:5 ' -GCTTGACACTGCTACTTGGAT-3 '（ SEQ IDN0·25)和下游引物CJR13:5'-TTCTATGCCTTGATTTTCTGC-3'（SEQIDN0·26)。
[0010] 進一步地，所述空腸彎曲菌的上游引物與下游引物的濃度比為1:1。
[0011] 進一步地，所述mnmA靶基因間隔片斷的長度為201bp，trpC靶基因間隔片斷的長度 為253bp，rpmH革E1基因間隔片斷的長度為315bp，acs革E1基因間隔片斷的長度為436bp，ansA革巴 基因間隔片斷的長度為500bp，ppk靶基因間隔片斷的長度為3170bp，metB靶基因間隔片斷 的長度為637bp，surE靶基因間隔片斷的長度為1270bp，rplT靶基因間隔片斷的長度為 823bp，dnaB靶基因間隔片斷的長度為923bp，ar sR靶基因間隔片斷的長度為1176bp，ksgA靶 基因間隔片斷的長度為2545bp，tonB靶基因間隔片斷的長度為1763bp。
[0012] 另外，本發明還提供了一種用于空腸彎曲菌快速分型的方法，包括如下步驟：
[0013 ] si應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取待測標本中的細菌基因組DNA;
[0014] S2以待測標本中的細菌基因組DNA為模板，采用權利要求1所述的13對空腸彎曲菌 引物分別進行PCR擴增；
[0015] S3將所得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。
[0016] 進一步地，所述步驟S1中待測標本中的細菌基因組DNA提取后的濃度為10-200ng/ μ1〇
[0017] 進一步地，所述步驟S2中的PCR擴增反應條件包括:階段1:94°C 5min;階段2:94°C 3〇8;階段3:511€3〇8;階段4:721€21^11 ;階段5:721€71^11;階段2-階段4循環35次 ；在4°(：貯 存。
[0018]除此之外，本發明還提供了所述的用于空腸彎曲菌快速分型的引物在制備用于快 速分型空腸彎曲菌試劑盒中的應用。
[0019] 本發明提供的用于空腸彎曲菌快速分型的方法:是利用空腸彎曲菌全基因組核酸 序列基因間隔片斷中相似度較低的基因間隔區域為靶序列，根據所有引物間的退火溫度差 在3 °C以內，PCR產物長度為100-3500bp，分別設計出13對空腸彎曲菌引物。使用這13對空腸 彎曲菌引物分別對待測菌株進行PCR擴增，依據所有擴增產物瓊脂糖凝膠電泳后呈現條帶 的數目及位置的多態性可達到對空腸彎曲菌分型的目的。
[0020] 本發明提供的用于空腸彎曲菌快速分型方法的結果判定方法是:對PCR產物的瓊 脂糖凝膠電泳圖的條帶數目和產物DNA片段長度進行分析，對于不同株的空腸彎曲菌13組 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖完全一致的判斷為相同的基因型。
[0021] 本發明提供的用于空腸彎曲菌快速分型的引物具有較好的分型能力和較高的分 辨指數，可以對空腸彎曲菌進行精確的分型。將本發明提供的13對空腸彎曲菌引物采用相 同的擴增反應條件，可一次性完成13個不同引物對的PCR反應，觀察凝膠電泳圖呈現條帶的 數目及位置可達到對空腸彎曲菌的分型，該方法具有操作簡便快捷、特異性好和準確度高 的優點，可以有效的輔助空腸彎曲菌感染疾病的臨床診斷。
[0022] 與現有技術相比，本發明的有益效果是:本發明提供的用于空腸彎曲菌快速分型 的引物具有更好的分型能力和更高的分辨指數，可以對空腸彎曲菌進行更精確的分型。此 外，本發明提供的用于空腸彎曲菌快速分型的方法具有操作簡便快捷、特異性好的優點，可 以有效的輔助空腸彎曲菌感染疾病的臨床診斷，是一種較為理想的空腸彎曲菌分型方法。
【具體實施方式】
[0023] 以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的 保護范圍。
[0024]實施例1、引物
[0025]本發明提供的用于空腸彎曲菌快速分型的引物。
[0026]表1本發明提供的引物
[0028]
[0029 ]實施例2、空腸彎曲菌各靶基因間隔片斷的長度
[0030] 本發明提供的mnmA靶基因間隔片斷的長度為201bp，trpC靶基因間隔片斷的長度 為253bp，rpmH革E1基因間隔片斷的長度為315bp，acs革E1基因間隔片斷的長度為436bp，ansA革巴 基因間隔片斷的長度為500bp，ppk靶基因間隔片斷的長度為3170bp，metB靶基因間隔片斷 的長度為637bp，surE靶基因間隔片斷的長度為1270bp，rplT靶基因間隔片斷的長度為 823bp，dnaB靶基因間隔片斷的長度為923bp，ar sR靶基因間隔片斷的長度為1176bp，ksgA靶 基因間隔片斷的長度為2545bp，tonB靶基因間隔片斷的長度為1763bp。
[0031] 表2空腸彎曲菌靶基因間隔片斷的長度
[0034]實施例3、一種用于空腸彎曲菌快速分型的方法 [0035] 1、空腸彎曲菌基因組DNA的提取：
[0036]取待測的36株空腸彎曲菌，分別在血瓊脂平板培養基上密集劃線，置于5%02、 10 % % N2的微需氧條件下，37 °C增菌培養24-48h后，刮取培養基上全部菌落至2ml ddH2〇中，禍旋振蕩混勾后再于lOOOOrpm離心2min，棄其上清液，按照Takara公司的細菌基 因組DNA小量純化試劑盒進行操作，分別提取36株空腸彎曲菌基因組DNA，提取后的DNA濃度 為10-200ngAU。所得的基因組DNA在檢測前于-20°C保存備用。
[0037] 2、待測菌株不同基因間隔片斷的PCR擴增：
[0038] 以本發明實施例1提供的空腸彎曲菌基因分型的13對空腸彎曲菌引物，分別對36 株待測菌株中的13個靶基因間隔片斷進行PCR擴增：
[0039] 2.1、擴增體系為25μ1:在PCR反應管中分別加入反應液22μ1，其組成均包括:2.5μ llOXTaq DNA Polymerase Buffer,0.5μ1 lOmM dNTPs,0.15yl 5U/yl Taq DNA Polymerase，17.85μ1 ddH2〇和ΙμL待檢模板;然后再于相應管中分別加入10μΜ的兩條引物 各1·5μ1;
[0040] 2.2、將上述各PCR管混勻稍離心后置于PCR儀上進行以下反應：①94°C預變性 5min，②94°C變性30s，③51°C退火30s，④72°C延伸2min，⑤72°C延伸7min，其中②-④步循 環35次。3、PCR產物的電泳檢測：
[00411將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，取3μ1擴增產物與0.5μ1上樣緩沖液混勻后點樣 于含0.5mg/L GoldView的1.5%瓊脂糖凝膠孔中，100V電泳45min后置于凝膠成像系統中成 像，觀察PCR擴增產物條帶情況，以實施例2的靶基因間隔片斷的長度進行結果判斷。結果如 表3所示：
[0042] 表3 36株空腸彎曲菌PCR產物及基因型
[0044]
[0045] 如表3所示:0代表沒有出現擴增產物，1代表擴增產物長度與靶基因間隔片斷預期 長度相同，la-lh分別代表擴增產物電泳條帶為1條，但產物長度與靶基因間隔片斷預期長 度不相同，且相互之間也不相同。2a和2b分別代表擴增產物電泳條帶為2條，其中一個條帶 呈現的序列長度與靶基因間隔片斷預期長度相同，另一個條帶呈現的序列長度互不相同。 3a和3b分別代表擴增產物電泳條帶為3條，其中一個條帶呈現的序列長度與靶基因間隔片 斷預期長度相同，另外兩個條帶呈現的序列長度各不相同。
[0046] 4、擴增產物的基因測序鑒定：
[0047] 對出現電泳條帶的菌株，采用上述方法重新進行PCR擴增，擴增體系按比例擴大至 50μ1，將PCR產物全部點樣進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后切取凝膠上的條帶，按照Takara公 司的DNA凝膠回收試劑盒進行操作，分別回收所有PCR產物。將純化的PCR產物分別與pGEM-T 克隆質粒用T4連接酶連接，轉化大腸桿菌E. co 1 i DH5a，挑取白色菌落進行PCR擴增鑒定，增 菌后送廣州英駿生物技術有限公司測序。按照表3所示的結果，將顯示為1的PCR產物測序結 果與美國國立衛生研究院GenBank數據庫(DNA序列數據庫）中的基因序列進行比對，結果與 相應的靶基因間隔片斷序列完全相同。將表3中顯示為其它相同字符的PCR產物測序結果分 組比對，同源性均達100%。顯示了本發明提供的空腸彎曲菌引物的準確性。
[0048] 5、AILP基因分型能力比較：
[0049]根據前期基因分型金標準PFGE分型的結果，待測的36株空腸彎曲菌分為21個基因 型，如表3所示，根據表3中瓊脂糖凝膠電泳圖的條帶數目和產物DNA片段長度，36株菌株中， 13組PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖完全一致的判斷為相同的基因型。
[0050]本發明提供的AILP方法可將這36株菌株分為24個基因型，其中CJ21和CJ22為不同 的型，CJ32和CJ33為不同的型，但PFGE分型結果是CJ21和CJ22為相同的型，CJ32和CJ33為相 同的型。兩種分型方法對其它菌株的分型結果均一致。表明了本發明提供的基因分型方法 比PFGE方法具有更好的分型能力。
[00511 6、AILP基因分型的分辨指數：
[0052]米用Hunter-Gaston分辨指數（Hunter-Gaston discriminatory index，HGDI)評 價AILP基因分型對空腸彎曲菌菌株的分辨能力，公式如下：
[0054] 其中，N為實驗菌株總數，S代表不同基因型的數目，nj代表第j個基因型的菌株數。
[0055] 采用上述公式分別計算本發明提供的空腸彎曲菌基因分型檢測引物組所對應的 13個靶基因間隔位點、各種不同位點組合及PFGE基因分型的分辨指數，并從每類位點個數 相同的組合中優選出分辨指數最高的位點組合，如表4所示。
[0056] 表4不同位點組合及PFGE基因分型分辨能力比較
[0057]
[0058] 由表4可知，本發明提供的空腸彎曲菌基因分型檢測引物組所對應的13個位點可 將36株空腸彎曲菌分為24個基因型，分型指數為0.968;表4第3行所示的8個位點也可將36 株空腸彎曲菌分為24個基因型，分型指數同為0.968;表4第4-8行所示的2-7個位點可將36 株空腸彎曲菌分為10-21個基因型，分型指數為0.832-0.954;單個位點呈現多態性最好的 是tonB，分型指數為0.706。證明本發明提供的AILP分型檢測引物組分辨指數極高，最低優 選7對引物對應的7個位點就可實現比PFGE分型更高的分辨指數。
[0059] 7、AILP基因分型檢測重復性的評價：
[0060]將待測36株空腸彎曲菌的AILP基因分型實驗分別由不同的操作者使用不同的PCR 儀重復3次，結果與表3顯示的結果完全一致。證明本發明提供的分型方法具有很好的重復 性。
【主權項】
1. 一種用于空腸彎曲菌快速分型的引物，其特征在于，包括以下13對空腸彎曲菌引物： 針對mnmA基因的上游引物CJFl: 5 ' -TTTCTCCGTAGTTGGGTCC-3 '和下游引物CJRl: 5 ' -GGTGCTTTGCCTTATCGTG-3 ' ；針對trpC基因的上游引物CJF2:5 ' -AGGAACAAGCAAAGTAGGTGG-3 ' 和下游引物CJR2 : 5 ' -AGCCATTCTAAGTCCAAAGC-3 ' ；針對rpmH基因的上游引物CJF3 : 5 ' -TATCCCAAGATGGTAAAAGCA-3' 和下游引物CJR3:5' -CACCCCATTGGATAACAGAG-3 ' ；針對acs基因 的上游引物CJF4:5'-TGCTACAGGCACAGGAAAA-3'和下游引物 CJR4:5'_ AAGCTGAGTCGCATAAGAAAA-3 ' ；針對ansA基因的上游引物CJF5:5 ' -GGAAACAACCCAGACTACCA-3 ' 和下游引物CJR5:5 ' -GACTAACCCTACGATGACGAG-3 ' ；針對ppk基因的上游引物CJF6: 5 ' -TGAAGCAAGTATGGAAGGAGT-3 ' 和下游引物CJR6:5 ' -AGATGAGCGAAGTAGGGTGA-3 ' ；針對metB基 因的上游引物CJF7 : 5 ' -GCGACATTATCTCCCGAACT-3 ' 和下游引物CJR7 : 5 ' -AGGCTTAGGCTTGAACTGC-3 ' ；針對surE基因的上游引物CJF8:5 ' -CTTGGTGGAGTGGGTGGAA-3 ' 和 下游引物CJR8 : 5 ' -CAGAAGTGGGAGATAARGTGA-3 ' ；針對rplT基因的上游引物CJF9 : 5 ' -GTCATTCAAACTCCCCTCTG-3 ' 和下游引物CJR9:5 ' -GCTGGAAAACTTGGTCGTG-3 ' ；針對dnaB基因 的上游引物CJFlO : 5 ' -AGGTGAAGAAATGGAAAGGG-3 ' 和下游引物CJRlO : 5 ' -GCCGCTGAAATACATAAAGAA-3 ' ；針對arsR基因的上游引物CJFl 1:5 ' -AGGGAACTTGGGCGTATTA-3 ' 和下游引物CJRl 1:5 ' -CCATCGTTTGCTTTTGTATTT-3 ' ；針對ksgA基因的上游引物CJFl2:5 ' -AGTGCAGGGGAGATAGTYG-3 ' 和下游引物CJR12:5 ' -AAGCATCAAAAGCATAAGAGG-3 ' ；針對tonB基 因的上游引物CJF13 : 5 ' -GCTTGACACTGCTACTTGGAT-3 ' 和下游引物CJR13 : 5 ' -TTCTATGCCTTGATTTTCTGC-3'。2. 如權利要求1所述的用于空腸彎曲菌快速分型的引物，其特征在于，所述空腸彎曲菌 的上游引物與下游引物的濃度比為1:1。3. 如權利要求1所述的用于空腸彎曲菌快速分型的引物，其特征在于，所述mnmA靶基因 間隔片斷的長度為201bp，trpC靶基因間隔片斷的長度為253bp，rpmH靶基因間隔片斷的長 度為315bp，acs靶基因間隔片斷的長度為436bp，ansA靶基因間隔片斷的長度為500bp，ppk 靶基因間隔片斷的長度為3170bp，metB靶基因間隔片斷的長度為637bp，SUrE靶基因間隔片 斷的長度為1270bp，rplT靶基因間隔片斷的長度為823bp，dnaB靶基因間隔片斷的長度為 923bp，arsR靶基因間隔片斷的長度為1176bp，ksgA靶基因間隔片斷的長度為2545bp，tonB 靶基因間隔片斷的長度為1763bp。4. 一種用于空腸彎曲菌快速分型的方法，其特征在于，包括如下步驟： Sl應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取待測標本中的細菌基因組DNA; S2以待測標本中的細菌基因組DNA為模板，采用權利要求1所述的13對空腸彎曲菌引物 分別進行PCR擴增； S3將所得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。5. 如權利要求4所述的用于空腸彎曲菌快速分型的方法，其特征在于，所述步驟Sl中待 測標本中的細菌基因組DNA提取后的濃度為10-200ngAU。6. 如權利要求4所述的用于空腸彎曲菌快速分型的方法，其特征在于，所述步驟S2中的 PCR擴增反應條件包括：階段l:94°C5min;階段2:94°C30s;階段3:51°C30s;階段4:72°C 2min;階段5:72 °C 7min;階段2至階段4循環35次;在4 °C貯存。7. 如權利要求1所述的用于空腸彎曲菌快速分型的引物在制備用于快速分型空腸彎曲 菌試劑盒中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886622SQ201610272800
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】畢水蓮, 羅永文
【申請人】廣東藥學院