紫薇矮化株型snp分子標記及應用

紫薇矮化株型snp分子標記及應用
【專利摘要】本發明涉及紫薇矮化株型SNP分子標記及應用。本發明利用SLAF?seq技術開發出3個紫薇株型SNP分子標記M16337、M25207和M38412，它們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1?3所示。將本發明的3個分子標記用于輔助選擇育種，可以實現苗期提早選擇，減少工作量，從而加快紫薇育種進程。
【專利說明】
紫薇矮化株型SNP分子標記及應用
技術領域
[0001] 本發明涉及分子生物學及植物分子育種領域，具體地說，涉及紫薇矮化株型SNP分 子標記及應用。
【背景技術】
[0002] 紫薇(Lagerstroemia indica)是我國的傳統木本花丼，有1800多年的栽培歷史 (張啟翔，1991)，樹姿優美、花色艷麗、花期極長，在園林中得到了廣泛的應用。紫薇作為一 種優良觀賞花木，在應用形式上較為單一，多以喬木狀的大花紫薇和灌木狀的紫薇品種為 主，迷你型的紫薇盆栽還有待開發。紫薇矮生品種成年植株高度僅30-60cm，因具有株型緊 湊、分枝多、節間短、花期長等優良特性，既可用作觀花地被、綠蘺植物，也可用于盆栽觀賞 而具有珍貴的科研價值和廣闊的市場前景。但目前缺乏可以用于株高性狀輔助選擇的分子 記 D
[0003] Ye等（2015)利用AFLP和SSR分子標記技術對矮化性狀進行定位，得到一個與矮化 基因遺傳距離為23.33cM的AFLP標記，重組率超過10%，難以用于紫薇矮化分子標記輔助選 擇育種。由于紫薇缺乏基因組信息，使用傳統技術開發分子標記費時費力，定位的成功率 低。
[0004] SLAF_seq(Specific Length Amplified Fragment Sequencing)為分子標記的開 發提供了一條新思路，當與高通量測序技術相結合時，優勢更為突出。鑒于其測序的準確 性，該技術在基因挖掘及高密度遺傳圖譜的構建中得到了廣泛應用。本發明利用SLAF-seq 技術開發了一批特異性強、穩定性高的紫薇株型的SNP標記，為克隆矮化基因及進行分子標 記輔助選擇育種提供重要基礎。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供紫薇矮化株型SNP分子標記及應用。
[0006] 為了實現本發明目的，本發明是以屋久島紫薇為母本，紫薇品種'Pocomoke'為父 本雜交獲得的142株分離群體為試材，構建株型正常/矮化基因池，開展紫薇矮化株型性狀 分子標記的開發及標記輔助選擇育種體系的建立。
[0007] 本發明提供的紫薇矮化株型SNP分子標記，包括3個SNP分子標記M16337、M25207和 M38412，它們的核苷酸序列分別如SEQIDN0:l-3所示。
[0008] 本發明還提供用于擴增所述分子標記的特異性PCR引物。
[0009] 標記M16337引物序列為：
[0010] 正向引物 W -CCGTGATAATAATGGTAG-3'
[0011] 反向引物：5' -ATGTGAGTCATTGTGGAT-3'
[0012] 標記M25207引物序列為：
[0013] 正向引物：5' -GTAGACAGACGTATACAGC-3'
[0014] 反向引物：57 -CGTTGACATTGCCAC-3'
[0015] 標記M38412引物序列為：
[0016] 正向引物：5' -GATGCCACCTGAAGTTATT-3'
[0017] 反向引物：5' -GATTTTCCGGCGACTC-3'
[0018] 本發明還提供所述分子標記在鑒定紫薇矮化株型中的應用，包括以下步驟：
[0019] 1)提取待測植株的基因組DNA;
[0020] 2)以待測植株的基因組DNA為模板，利用擴增所述分子標記的引物，進行PCR擴增 反應；
[0021] 3)檢測PCR擴增產物。擴增產物進行Sanger測序，如果擴增產物相應SNP位點表現 雜合，則待測植株為紫薇正常株型，如果相應SNP位點表現純合，則待測植株為矮化株型;其 中，對應于標記M16337的SNP位點，位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位堿基，該處堿基為A 或G，對應于標記M25207的SNP位點，位于SEQ ID NO: 2所示序列的第412位堿基，該處堿基為 T或C，對應于標記M38412的SNP位點，位于SEQ ID N0:3所示序列的第375位堿基，該處堿基 為C或T。
[0022] 步驟2)中PCR擴增體系為：100ngyL-1模板DNA lyL，2XTaq PCR Master Mix 12·5μ L，1 Ομπιο 1 L-1正、反向引物各0 · 6yL，ddH20 10 · 3yL; PCR反應程序為：94 °C預變性5min; 94 °C 變性30s，45°C-60°C (依引物而定)退火lmin，72°C延伸3〇8,35個循環;72°(：終延伸1〇11^11。
[0023] 本發明還提供用于AS-PCR擴增所述分子標記的ASP引物。
[0036]本發明還提供一種篩選或鑒定紫薇矮化株型的方法，所述方法包括以下步驟： [0037] 1)提取待測植株的基因組DNA;
[0038] 2)以待測植株的基因組DNA為模板，利用擴增所述分子標記的ASP引物，進行AS- PCR擴增反應；
[0039] 3)檢測擴增產物。如果擴增產物相應SNP位點表現雜合，則待測植株為紫薇正常株 型，如果相應SNP位點表現純合，則待測植株為矮化株型；其中，對應于標記M16337的SNP位 點，位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位堿基，該處堿基為A或G，對應于標記M25207的SNP 位點，位于SEQ ID N0: 2所示序列的第412位堿基，該處堿基為T或C，對應于標記M38412的 SNP位點，位于SEQ ID N0:3所示序列的第375位堿基，該處堿基為C或T。
[0040]步驟2)中AS-PCR擴增體系為：lOOngyL-1模板DNA lyL，2XTaq PCR Master Mix 12.5yL，10ymol L-1 正向引物0.6yL，10ymol L-1 反向引物 1 或2 0.6yL，ddH20 10.3yL;PCR反 應程序為：94°C預變性5min;94°C變性30s，45°C_60°C (依引物而定）退火lmin，72°C延伸 30s，35個循環；72°C終延伸lOmin。
[0041] 本發明還提供含有所述特異性PCR和/或所述ASP引物的用于篩選或鑒定紫薇矮化 株型的檢測試劑盒。
[0042] 本發明進一步提供所述分子標記在紫薇分子標記輔助育種中的應用。
[0043]本發明具有以下優點：
[0044](一）本發明利用SLAF-seq技術開發紫薇株型分子標記，其周期短、成本低、效率 高，可為在其他無參考基因組物種中開發特異性分子標記提供重要參考，也為分子育種、遺 傳多樣性、分子標記輔助選擇育種提供了重要的開發途徑。
[0045] (二)本發明獲得的SNP分子標記在不同樣本和不同群體中表現重復性好、擴增穩 定，不受環境條件的影響。
[0046] (三)本發明提供的ASP引物用于AS-PCR擴增反應，操作簡單，能夠克服紫薇不同基 因型鑒定的困難。
[0047] (四）將本發明篩選出的3個分子標記用于輔助選擇育種，可以實現苗期提早選擇， 減少工作量，從而加快紫薇育種進程。
【附圖說明】
[0048]圖1為本發明實施例4中標記則6337在？1群體中AS-PCR的擴增結果；其中，M: MarkerDL2000; 1-8:矮生個體;9-16:正常個體。
[0049]圖2為本發明實施例4中標記1125207在？1群體中AS-PCR的擴增結果；其中，M: MarkerDL2000; 1-8:矮生個體;9-16:正常個體。
[0050]圖3為本發明實施例4中標記138412在？!群體中AS-PCR的擴增結果；其中，M: MarkerDL2000; 1-8:矮生個體;9-16:正常個體。
[0051 ] 圖4顯示本發明實施例4中標記M16337在BC!群體中AS-PCR的擴增穩定性;其中，M: MarkerDL2000; 1 -6:矮生個體;7-12:正常個體。
[0052] 圖5顯示本發明實施例4中標記M25207在BC!群體中AS-PCR的擴增穩定性;其中，M: MarkerDL2000; 1 -6:矮生個體;7-12:正常個體。
[0053] 圖6顯示本發明實施例4中標記M38412在BC!群體中AS-PCR的擴增穩定性;其中，M: MarkerDL2000; 1 -6:矮生個體;7-12:正常個體。
[0054]圖7顯示本發明實施例4中標記在?:群體中輔助選擇育種準確性;其中，a:單標記 的準確性;b:雙標記組合的準確性。
[0055]圖8顯示本發明實施例4中標記在隊:群體中輔助選擇育種準確性;其中，a:單標記 的準確性;b:雙標記組合的準確性。
【具體實施方式】
[0056]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0057]實施例1基于SLAF-seq技術開發紫薇株型性狀分子標記 [0058] 1、實驗材料
[0059] 供試材料包括母本屋久島紫薇（L. fauriei )、父本紫薇'Pocomoke '（L. indica 'Pocomoke'）及以其為親本雜交獲得的142株?1株型分離群體。親本在表型性狀上差異顯 著，母本喬木狀，株型直立開展，葉片大，節間長，父本為低矮灌木，株型緊湊，葉片小，節間 短。此外，92株株型分離群體用于分子標記的驗證。根據目標性狀，于生長季結束（11月 份)后測定各群體后代的株型性狀，以正常型實生苗的平均高度為對照，其1/2以下劃分為 矮生型。所有材料均定植于國家花卉工程移栽技術研究中心北京小湯山實驗基地（北煒 ，東經E115°50/ )。
[0060] 2、基因組DNA的提取
[00611隨機選取？:群體中正常和矮生株型的單株各50株，提取DNA后等量混合分別構建 正常型和矮生型基因池。DNA提取按照新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限 公司）說明進行，制備1.0%瓊脂糖凝膠，吸取3yL DNA混合約2yL加樣緩沖液，電壓90V，電泳 30min，檢測是否有降解、RNA和蛋白質污染等問題。用NANO DR0P2000測定DNA濃度，并分析 其純度，確保DNA濃度在lOOIOOngyL-1。
[0062] 3、紫薇株型性狀分子標記的開發
[0063]利用酶切預測軟件SLAF_PrediCt(北京百邁客生物科技有限公司）對紫薇基因組 進行系統分析，主要根據基因組的GC含量、重復序列情況和基因特點等信息，設計標記開發 方案，確定酶切組合、切膠范圍及測序量等，以保證其分子標記開發的密度和均勻性，從而 確保達到預期的實驗目的。
[0064]分別取親本、正常型和矮生型基因池4個樣品的DNA 500ng，加入限制性內切酶酶 切3h。反應結束后用Quick Spin column(Qiagen)純化酶切產物，并用33yL EB回收。以回收 的酶切產物為模板進行PCR反應，反應體系為25yL，包括模板DNA 100ng，10 X PCR反應緩沖 液2.5yL，2.5mmolL-MNTP 的Taq DNA合成酶（NEB)0.3yL，10ymol I^Msel 引物2μ L，ddH20加至25yL。PCR產物經純化后，加入Mse I、T4DNA連接酶、ATP及So 1 exa接頭，37 °C反應 5h。純化產物后2%瓊脂糖電泳，用Gel Extraction Kit(Qiagen)回收電泳中300_500bp的 條帶，并以其為模板，在含Phusion Master Mix(NEB)和Solexa引物混合物中進行PCR擴增， 擴增產物經純化后用Illumina GAIIx(11 lumina，San Diego，CA，USA)測序。完成4個樣品的 DNA測序，保證獲得不低于50000個SLAF標簽，標簽整體平均深度達到120 X。利用軟件SLAF-Poly.pl.(北京百邁客生物科技有限公司）對測序得到的reads數據進行評估和低質量過 濾，再利用比對軟件BLAT將各樣品有效數據進行相似度聚類，并通過深度識別，基因型糾錯 后，得到有效的SLAF片段。
[0065] 利用SLAF-seq技術完成對樣品的測序，共獲得樣品的有效reads為32.15M條，SLAF 標簽79863個，整體平均深度197.9X，達到簡化基因組的預期目標(表1)。
[0066]表1樣品數據量統計
[0067]
[0068] 對篩選得到的Marker采用SNP-index關聯方法進行檢驗分析，獲得顯著性差異標 記。Maa表示aa群體來源于Μ的深度;Paa表示aa群體來源于P的深度;Mab表示ab群體來源于Μ 的深度;Pab表示ab群體來源于Ρ的深度；
[0069] SNP-index(aa) =Maa/(Paa+Maa)
[0070] SNP-index(ab) =Mab/(Pab+Mab)
[0071 ] Delta(SNP-index)=SNP-index(ab)-SNP_index(aa)
[0072] 根據遺傳連鎖可以推測，如果該Marker與目標性狀相關，則兩個群體中的SNP-index都會顯著偏離0.5(隱池中的SNP-index會接近于1)，〇6]^&(3即-;[11(161)會顯著偏離0。 該Marker與目標性狀相關性越高，Delta(SNP-index)偏離0的程度越大，即更接近1。選擇 Delta(SNP-index)>0· 3的Marker為差異標記，即更可能與性狀相關。
[0073] 實施例2根據紫薇株型差異性標記設計引物
[0074]利用SLAF-seq技術共獲得紫薇矮化株型性狀特異標簽38個。根據測序結果，選擇3 個Marker(M16337、M25207、M38412)利用Primer Premier5.0設計引物，引物序列見表2〇 [0075]表2用于Sanger測序的3對引物信息
[0076]
[0077] 隨機挑選30株極端個體進行PCR擴增。PCR擴增體系25yL，含lOOngyL-1模板DNA 1μ L，2XTaq PCR Master Mix(艾德萊）12.5yL，10ymol L-1正向和反向引物（上海生工）各0·6μ L，ddH2〇 10·3μΙ^ΡΟ?程序為:94°C 預變性 5min;94°C 變性 30s，45°C-60°C (依引物而定)退火 lmin，72°C延伸3〇8,35個循環；72°(：終延伸1〇1^11。？0?產物純化后直接進行3&1^64則序（北 京睿博興科生物技術有限公司），將子代與親本的結果進行對照，確定該標記含有真實的 SNP，且標記與目的性狀的緊密關聯。
[0078] 實施例3基于SLAF標記建立AS-PCR方法進行基因分型
[0079] 利用Sanger測序獲得SLAF片段全長后（即標記M16337、M25207和M38412,核苷酸序 列分別如SEQ ID N0:1-3所示），對相應的SNP位點設計AS-PCR引物。引物設計時，在等位基 因特異性引物(ASP)的3'末端分別與SNP位點的兩個堿基完全匹配，同時在特異性引物3'末 端的倒數第2或第3位置引入1個錯配堿基，以此提高PCR的特異性及穩定性。AS-PCR操作過 程中需將兩條ASP引物與其公用引物分別組對，在兩個PCR管中對同一 DNA模板進行PCR擴 增。若樣品中的等位位點與ASP引物的3'末端相匹配，便能進行有效擴增，反之則不能進行 有效擴增。
[0080] AS-PCR反應體系為25yL，含lOOngyL-1 模板DNA lyL，2XTaq PCR Master Mix(艾德 萊）12.5yL，1 Ομπιο 1 L-1正向和反向引物(上海生工)各0.6yL，ddH2〇 10.3yL。反應程序為:94 °(：預變性5!1^11;94°(：變性3〇8,45°(：-60°(：(依引物而定）退火11^11，72°(：延伸3〇8,35個循環 ； 72°C終延伸10min。擴增結束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，統計各群體所有單株 的基因型。如果相應SNP位點表現雜合，則標志著樣本材料為正常株型，如果相應SNP位點表 現純合，則標志著樣本材料為矮化株型。其中，對應于標記M16337的SNP位點，位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位堿基，該處堿基為A或G，對應于標記M25207的SNP位點，位于SEQ ID NO: 2所示序列的第412位堿基，該處堿基為T或C，對應于標記M38412的SNP位點，位于SEQ ID NO: 3所示序列的第375位堿基，該處堿基為C或T。
[0081 ]用于AS-PCR擴增的3對標記引物信息見表3。
[0082]表3用于AS-PCR擴增的3對引物信息
[0083]
[0084] 實施例4標記的準確性、穩定性、重復性檢測
[0085] 用得到的3個標記組6337、]\125207、]\08412對？1群體142個單株進行43-?0財廣增驗 證，標記的鑒定結果見圖7，發現準確率最高的為M25207，高達80%，其中各標記在矮化個體 中的成功率顯著高于正常個體，M25207在矮化個體中準確率高達84%。同時利用標記組合 M16337+M25207進行表型鑒定時，成功率高達90%，且在矮生個體中達93%。由此可見，開發 的SNP標記可以用于紫薇Fi群體矮化株型性狀的輔助選擇育種中。
[0086] 獲得的特異性分子標記是否穩定對其應用也是非常重要的，通過相同引物對不同 的分離群體進行擴增，如果能獲得穩定的條帶，說明開發的標記是穩定的，可用于紫薇不同 株型的鑒定。以92株群體為材料，驗證所開發的SNP標記的穩定性及準確率。以M38412為 例，其在正常株型個體擴出兩條帶，為CT雜合，在矮化株型個體中擴出一條帶，為CC純合，說 明3個標記在群體中也能較好的鑒定不同的表型，具有很好的穩定性。3個標記在隊:群體 中表型鑒定準確率略微下降，單標記M25207準確率為77%，雙標記組合準確率為84% (圖 8)。其中，圖1-圖3分別為標記組6337、]\125207和]\08412在?1群體中45-?0?的擴增結果。圖4-圖6分別顯示標記M16337、M25207和M38412在BCi群體中AS-PCR的擴增穩定性。
[0087] 本發明建立的分子標記輔助選擇育種可以實現苗期提早選擇、減少工作量，大大 提高了紫薇株型的選擇效率，從而加快育種進程。
[0088] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。 [0089] 參考文獻
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【主權項】
1. 紫薇矮化株型SNP分子標記，其特征在于，包括3個SNP分子標記M16337、M25207和 M38412,它們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 1-3所示。2. 用于擴增權利要求1所述分子標記的特異性PCR引物，其特征在于， 標記M16337引物序列為： 正向引物:5' -CCGTGATAATAATGGTAG-3' 反向引物：5' -ATGTGAGTCATTGTGGAT-3' 標記M25207引物序列為： 正向引物：5' -GTAGACAGACGTATACAGC-3' 反向引物：5' -CGTTGACATTGCCAC-3' 標記M38412引物序列為： 正向引物：5' -GATGCCACCTGAAGTTATT-3' 反向引物：5' -GAITTTCCGGCGACTC-3'。3. 權利要求1所述分子標記在鑒定紫薇矮化株型中的應用，其特征在于，包括以下步 驟： 1) 提取待測植株的基因組DNA; 2) 以待測植株的基因組DNA為模板，利用擴增所述分子標記的引物，進行PCR擴增反應； 其中，用于擴增所述分子標記的引物序列同權利要求2所述； 3) 檢測PCR擴增產物，如果擴增產物相應SNP位點表現雜合，則待測植株為紫薇正常株 型，如果相應SNP位點表現純合，則待測植株為矮化株型；其中，對應于標記M16337的SNP位 點，位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位堿基，該處堿基為A或G，對應于標記M25207的SNP 位點，位于SEQ ID NO: 2所示序列的第412位堿基，該處堿基為T或C，對應于標記M38412的 SNP位點，位于SEQ ID NO: 3所示序列的第375位堿基，該處堿基為C或T。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟2)中PCR擴增體系為=IOOngyI/1模板 DNA lyL，2XTaq PCR Master Mix 12.5yL，10ymol L-1 正、反向引物各0.6yL，ddH20 10·3μ L;PCR 反應程序為:94°C 預變性 5min;94°C 變性 30s，45°C-60°C 退火 lmin，72°C 延伸 30s，35 個 循環;72 °C終延伸I Omin。5. 用于AS-PCR擴增權利要求1所述分子標記的ASP引物，其特征在于， 標記M16337引物序列為： 正向引物：5' -TCCCGTGGCTCTAACCTCT-3' 反向引物1:5' -TCTTGAACCATTTTTTTCCCT-3' 反向引物2:5' -TCTTGAACCATTTTTTTCCCC-3' 標記M25207引物序列為： 正向引物:5' -TAGAACAAGACTCGGAAAA-3, 反向引物1:5' -CGCACATCGTACGTAAAA-3' 反向引物2:5' -CGCACATCGTACGTAAAG-3' 標記M38412引物序列為： 正向引物:5' -CCAACGAGCAGCATCCAAAG-3' 反向引物1:5' -GGCGACTCGAACTTCTCCG-3' 反向引物2:5' -GGCGACTCGAACTTCTCCA-3'。6. -種篩選或鑒定紫薇矮化株型的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取待測植株的基因組DNA; 2) 以待測植株的基因組DNA為模板，利用擴增權利要求1所述分子標記的ASP引物，進行 AS-PCR擴增反應； 其中，用于擴增所述分子標記的ASP引物序列同權利要求5所述； 3) 檢測擴增產物，如果擴增產物相應SNP位點表現雜合，則待測植株為紫薇正常株型， 如果相應SNP位點表現純合，則待測植株為矮化株型；其中，對應于標記M16337的SNP位點， 位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位堿基，該處堿基為A或G，對應于標記M25207的SNP位 點，位于SEQ ID NO: 2所示序列的第412位堿基，該處堿基為T或C，對應于標記M38412的SNP 位點，位于SEQ ID NO: 3所示序列的第375位堿基，該處堿基為C或T。7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中AS-PCR擴增體系為：IOOngyI/1模 板DNA lyL，2XTaq PCR Master Mixl2.5yL，10ymol L-1 正向引物0.6yL，10ymol L-1 反向引 物 1 或2 0.6yL，ddH20 10.3yL;PCR反應程序為：94°C預變性5min;94°C變性30s，45°C-60°C 退火lmin，72°C延伸3〇8,35個循環;72°(：終延伸1〇11^11。8. 含有權利要求2和/或權利要求5所述引物的用于篩選或鑒定紫薇矮化株型的檢測試 劑盒。9. 權利要求1所述分子標記在紫薇分子標記輔助育種中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886640SQ201610326992
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】潘會堂, 葉遠俊, 張啟翔, 蔡明 , 程堂仁, 王佳, 鞠易倩, 焦垚, 馮露
【申請人】北京林業大學