一種高活性粉狀畢赤酵母菌粉及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種高活性粉狀畢赤酵母菌粉及其制備方法，該制備方法包括活化培養、一級種子培養、制備高密度液體發酵培養基、發酵培養、補料與添加輔料等步驟。該制備方法可顯著提高單位產量30％左右，降低單位成本20％左右，大大提高了設備利用率；復合保護劑和載體賦予了菌體本身最佳保護，從而可以獲得高活性粉狀畢赤酵母菌粉；本發明與傳統離心噴霧干燥生產工藝相比，采用冷風干燥技術干燥溫度較低，更好地保留了生物活性，克服了傳統工藝低活菌、高投入的缺點，具有廣闊的市場前景。
【專利說明】
一種高活性粉狀畢赤酵母菌粉及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域。更具體地，本發明涉及一種高活性粉狀畢赤酵母菌粉的制備方法，還涉及采用所述制備方法制備得到的高活性粉狀畢赤酵母菌粉。
【【背景技術】】
[0002]粉狀畢赤酵母作為工業菌種具有非常廣泛的用途。它不僅可以治理養殖業生產過程中氨氮的排放，還可以為畜禽類提供優質活性蛋白，提高畜禽產品質量;一些研究工作表明，粉狀畢赤酵母不僅對土壤鹽堿性有良好的改良效果，以及對根結線蟲有較強的抑制作用，而且還可以提高作物產量;粉狀畢赤酵母可促進有機物料腐熟，是有機物料腐熟劑生產中的重要菌種;粉狀畢赤酵母在有機肥堆肥發酵過程中可抑制畜禽糞便氨氣揮發，起到除氨保氮的作用。由此可見，大力發展粉狀畢赤酵母產業有非常廣闊的市場前景。
[0003]目前市場上的粉狀畢赤酵母菌粉較少，活菌數較低，穩定性也較差。主要是由于其本身耐受性較低，不適合進行噴霧干燥，然而冷凍干燥成本又相對較高，因此嚴重制約了粉狀畢赤酵母產業化生產。
[0004]針對現有技術存在的技術缺陷，本發明人在總結現有技術基礎之上，通過大量實驗研究與分析，終于完成了本發明。
【
【發明內容】
】
[0005][要解決的技術問題]
[0006]本發明的目的是提供一種高活性粉狀畢赤酵母菌粉的制備方法。
[0007]本發明的另一個目的是提供采用所述制備方法制備得到的高活性粉狀畢赤酵母菌粉。
[0008][技術方案]
[0009]本發明是通過下述技術方案實現的。
[0010]本發明涉及一種粉狀畢赤酵母高活性菌粉的制備方法。
[0011]該制備方法的步驟如下:
[0012]A、活化培養
[0013]用無菌吸管吸取0.3?0.5mL麥芽汁液體培養基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養基中，在溫度26?30°C下活化培養2?3d;
[0014]按照以YPD培養基重量計3?5%接種量，將活化培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于Yro培養基斜面上，在溫度26?30 °C下斜面培養2?3d;
[0015]B、一級種子培養
[0016]使用接種環挑取一環斜面培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于50?80mL YPD液體培養基中，在溫度28?32°C與轉速200?250rad/min條件下振蕩培養，直到培養液OD60qim達到12.0?15.0時得到一級種子液；
[0017]C、制備高密度液體發酵培養基
[0018]將I?3重量份葡萄糖、0.5?1.5重量份蛋白胨、0.1?0.5重量份磷酸二氫鉀、0.01?0.05重量份硫酸鎂、0.03?0.06重量份硫酸亞鐵、0.03?0.06重量份硫酸錳與補充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.11?0.15MPa與溫度121°C?125 °C的條件下滅菌18?22min，接著使用濃度為以體積計22?28%的氨水將其pH值調節至5.0?6.0，得到一種高密度液體發酵培養基；
[0019]D、發酵培養
[0020]按照以液體發酵培養基重量計6?10%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發酵培養基中，在培養溫度28?32°C、初始pH 5.5、壓力0.03?0.06MPa、轉速200?350rad/min與通氣比1:1?2.5的條件下進行發酵培養;與此同時，通過通氣比、壓力與轉速調整，將整個發酵過程中溶解氧DO控制在320%，通過滴加濃度為以體積計22?28%的氨水將在整個發酵過程中發酵培養液的pH值控制在5.5?6.5;
[0021]E、補料
[0022]在整個發酵培養過程中，在通氣量、壓力與轉速不變時，如果溶解氧DO在Imin內升高30 %以上時，需要按照發酵培養基體積計18?22 %的添加量，往發酵培養液中添加由35?45重量份葡萄糖與5?15重量份硫酸鎂組成的補料培養基；
[0023]F、添加輔料
[0024]在發酵培養結束前0.5?lh，按照發酵培養基體積計I?3%的添加量添加甘露醇保護劑與2?6%的添加量添加吐溫80，充分混勻;接著在離心轉速2000?4000rpm的條件下離心濃縮2?4倍;再按照發酵培養基體積計20?30%的添加量添加米糠載體、20?30%的添加量添加加益粉載體，充分混勻，接著輸送至冷風干燥機中進行冷風干燥，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。
[0025]根據本發明的一種優選實施方式，在步驟A中，在按照大麥芽與水的重量比1:3?5，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度55?60°C下進行糖化3.5?4.5h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.5?0.7kg/cm2下滅菌38?42min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到一種麥芽汁液體培養基。
[0026]根據本發明的另一種優選實施方式，在步驟C與步驟D中，所述的氨水濃度是以體積計22?28 %。
[0027]根據本發明的另一種優選實施方式，在步驟C中，高密度液體發酵培養基由2重量份葡萄糖、I重量份蛋白胨、0.3重量份磷酸二氫鉀、0.03重量份硫酸鎂、0.05重量份硫酸亞鐵、0.05重量份硫酸猛與補充至1000重量份蒸饋水組成。
[0028]根據本發明的另一種優選實施方式，在步驟E中，所述的補料培養基在蒸汽壓力102?104kPa與溫度110?117°C的條件下滅菌18?22min。
[0029]根據本發明的另一種優選實施方式，在步驟E中，在整個發酵培養過程中添加8?10次所述的補料培養基。
[0030]根據本發明的另一種優選實施方式，整個發酵培養時間是36?48h。
[0031]根據本發明的另一種優選實施方式，在步驟F中，在溫度為5?15°C的條件下進行冷風干燥4?5h。
[0032]根據本發明的另一種優選實施方式，在步驟F中，所述的米糠載體粒度是100?150目。
[0033]本發明還涉及采用所述制備方法制備得到的高活性粉狀畢赤酵母菌粉。所述的粉狀畢赤酵母有效活菌數CFU ^ 60.0億/g ；雜菌率= 10.0%;水分5.5-7.0%； pH值5.5?6.5;在溫度25°C以下保存6個月時菌數保存率375%。
[0034]下面將更詳細地描述本發明。
[0035]本發明涉及一種高活性粉狀畢赤酵母菌粉的制備方法。
[0036]該制備方法的步驟如下:
[0037]A、活化培養
[0038]用無菌吸管吸取0.3?0.5mL麥芽汁液體培養基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養基中，在溫度26?30°C下活化培養2?3d;
[0039]按照以YPD培養基重量計3?5%接種量，將活化培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于Yro培養基斜面上，在溫度26?30 °C下斜面培養2?3d;
[0040]粉狀畢赤酵母ACCC20136是由中國農業微生物菌種保藏管理中心獲得的。使用75%酒精脫脂棉對裝有凍干粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿管外表面進行消毒，用火焰加熱其頂端，滴少量無菌水至加熱安瓿頂端使之破裂，用銼刀或鑷子敲下已經破裂的安瓿頂端。然后把麥芽汁液體培養基滴入安瓿內。
[0041]根據本發明，所述的麥芽汁液體培養基制備方法如下:按照大麥芽與水的重量比1:3?5，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度55?60°C下進行糖化
3.5?4.5h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.5?0.7kg/cm2下滅菌38?42min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到所述的麥芽汁液體培養基。
[0042]在本發明中，使用的大麥芽是目前市場上銷售的產品，例如由鄭州龍海啤酒物資有限公司銷售的大麥芽。
[0043]所述的麥芽汁液體培養基的pH是自然的pH。
[0044]YPD培養基是本技術領域里技術人員熟知的培養基，它的制備方法如下:將1g酵母膏、20g蛋白胨與20g葡萄糖溶于900mL水中，在溫度^丨^下滅菌]。!!!；^，得到所述的YF1D培養基。
[0045]B、一級種子培養
[0046]使用接種環挑取一環斜面培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于50?80mL YPD液體培養基中，在溫度28?32°C與轉速200?250rad/min條件下振蕩培養，直到培養液OD6OQnm達到12.0?15.0時得到一級種子液；
[0047]Yro液體培養基已在前面描述，因此這里不再贅述。
[0048]在本發明中，振蕩培養使用的設備例如是由蘇州威爾實驗用品有限公司以商品名振蕩培養箱銷售的設備。
[0049]通常利用分光光度法來測量單細胞微生物培養液的濃度，從而估計菌體的生長情況，所以0D_nm通常用來指菌體細胞密度。例如測量細菌培養液在波長600?處的吸光值，得至IJ的OD600nm的數值如果在0.6-0.8之間，表明細菌處于旺盛生長的對數生長期，超過0.8就要稀釋培養液。
[0050]培養液(?_?為12.0?15.0表明粉狀畢赤酵母正處于對數生長期，開始大量、快速繁殖。
[0051]測定0D6QQnm使用的設備是本技術領域里通常使用的分光光度計，測定0D6QQnm的方法是常規方法。
[0052]C、制備高密度液體發酵培養基
[0053]將I?3重量份葡萄糖、0.5?1.5重量份蛋白胨、0.1?0.5重量份磷酸二氫鉀、0.01?0.05重量份硫酸鎂、0.03?0.06重量份硫酸亞鐵、0.03?0.06重量份硫酸錳與補充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.1IM?0.15MPa與溫度121°C?125 °C的條件下滅菌18?22min，接著使用濃度為以體積計22?28%的氨水將其pH值調節至5.0?6.0，得到一種高密度液體發酵培養基；
[0054]優選地，高密度液體發酵培養基由2.0重量份葡萄糖、1.0重量份蛋白胨、0.3重量份磷酸二氫鉀、0.03重量份硫酸鎂、0.05重量份硫酸亞鐵、0.05重量份硫酸錳與補充至1000重量份蒸餾水組成。
[0055]本發明使用的葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳都是目前市場上銷售的產品。
[0056]在這個步驟中，所述的氨水濃度是以體積計22?28%。
[0057]D、發酵培養
[0058]按照以液體發酵培養基重量計6?10%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發酵培養基中，在培養溫度28?32°C、初始pH 5.5、壓力0.03?0.06MPa、轉速200?350rad/min與通氣比1:1?2.5的條件下進行發酵培養;與此同時，通過通氣比、壓力與轉速調整，將整個發酵過程中溶解氧DO控制在320%，通過滴加濃度為以體積計22?28%的氨水將在整個發酵過程中發酵培養液的pH值控制在5.5?6.5;
[0059]溶解于水中的分子態氧稱為溶解氧，通常記作D0，用每升水里氧氣的毫克數表示。溶解氧通常采用碘量法進行測定，即水樣中加入硫酸錳和堿性碘化鉀，水中溶解氧將低價錳氧化成高價錳，生成四價錳氫氧化物棕色沉淀。加酸后，氫氧化物沉淀溶解，并與碘離子反應而釋放出游離碘。以淀粉為指示劑，用硫代硫酸鈉標準溶液滴定釋放出的碘，據滴定溶液消耗量計算溶解氧含量。
[0060]在本發明中，將整個發酵過程中溶解氧DO控制在3 20 %，如果溶解氧D0<20%時，則粉狀畢赤酵母會因缺氧而進行厭氧呼吸途徑產生大量乙醇，通過反饋抑制作用抑制菌體生長。
[0061 ]根據本發明，在這個步驟中，所述的氨水濃度是以體積計22?28%。
[0062]在本發明中，如果在整個發酵過程中發酵培養液的pH值控制在5.5以下，則會引起細胞質膜的電性改變，影響營養吸收和代謝途徑;如果在整個發酵過程中發酵培養液的PH值控制在6.5以上，則會影響粉狀畢赤酵母自身酶系的酶活性及基質和產物性質，從而導致菌體生長速度變慢;因此，在整個發酵過程中發酵培養液的pH值控制在5.5?6.5是合理的，優選地是5.8?6.2 ；更優選地是5.9?6.1。
[0063]E、補料
[0064]在整個發酵培養過程中，在通氣量、壓力與轉速不變時，如果溶解氧DO在Imin內升高30 %以上時，需要按照發酵培養基體積計18?22 %的添加量，往發酵培養液中添加由35?45重量份葡萄糖與5?15重量份硫酸鎂組成的補料培養基；
[0065]在這個步驟中，溶解氧DO在Imin內升高30%以上時，表明發酵培養基中葡萄糖已耗盡，會造成菌體衰老死亡，同時出現pH升高，應及時補充碳源。因此，需要添加由35?45重量份葡萄糖與5?15重量份硫酸鎂組成的補料培養基，其中葡萄糖的主要作用是為粉狀畢赤酵母菌體生長補充必需的碳源，延長對數期，促進菌體大量積累；而硫酸鎂是許多酶的活化劑，能促進碳水化合物的新陳代謝、核酸的合成、磷酸鹽的轉化等。
[0066]在這個步驟中，所述的補料培養基在蒸汽壓力102?104kPa與溫度110?117°C的條件下滅菌18?22min。
[0067]在整個發酵培養過程中，所述的補料培養基通常需要添加8?10次。
[0068]根據本發明，整個發酵培養時間是36?48h。如果整個發酵培養時間小于36h，則發酵仍處于對數生長期，不能獲取最高濃度的發酵液;如果整個發酵培養時間長于48h，則發酵已進入穩定期乃至衰亡期，菌體數量將按幾何級數下降；因此，整個發酵培養時間為36?48h是合理的。
[0069]F、添加輔料
[0070]在發酵培養結束前0.5?lh，按照發酵培養基體積計I?3%的添加量添加甘露醇保護劑與2?6%的添加量添加吐溫80，充分混勻;接著在離心轉速2000?4000rpm的條件下離心濃縮2?4倍;再按照發酵培養基體積計20?30%的添加量添加米糠載體、20?30%的添加量添加加益粉載體，充分混勻，接著輸送至冷風干燥機中進行冷風干燥，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。
[0071]在本發明中，添加甘露醇保護劑的主要目的是可與菌體細胞膜磷脂中的磷酸基團或菌體蛋白質極性基團形成氫鍵，保護細胞膜和蛋白質結構和功能的完整性。如果甘露醇保護劑的添加量小于1%，則會影響粉狀畢赤酵母菌體存活率;如果甘露醇保護劑的添加量大于3%，則會使細胞間隙內的液體逐漸濃縮，從而使電解質的濃度顯著增加，發生溶質損傷效應，導致細胞脫水死亡;因此，甘露醇保護劑的添加量為I?3 %是恰當的。
[0072]添加吐溫80保護劑的主要目的是減少細胞暴露于氧氣和介質中的面積，同時在菌體表面形成保護層，減少由于細胞壁損傷而引起的胞內物質泄漏。如果吐溫80保護劑的添加量小于2%，則起不到最佳保護效果;如果吐溫80保護劑的添加量大于6%，則容易造成樣品發粘，不易干燥、保存；因此，吐溫80保護劑的添加量為2?6%是適當的。
[0073]在本發明中，添加米糠載體的主要目的是吸附粉狀畢赤酵母菌體。如果米糠的添加量小于20 %，則不能將發酵液中的菌體充分吸附；如果米糠的添加量大于30 %，則會減少單位質量中有效活菌數，影響產品質量；因此，米糠的添加量為20?30%是可行的。所述的米糠粒度是100?150目。
[0074]添加加益粉載體的主要目的是在產品使用過程中為菌體繁殖提供多種礦物質和無機鹽;改善產品外觀。如果加益粉載體的添加量小于20%，則不能為菌體生長繁殖提供充足的營養;如果加益粉載體的添加量大于30%，則會減少單位質量中有效活菌數，影響產品質量;因此，加益粉載體的添加量為20?30%是恰當的。
[0075]冷風干燥技術是利用空調除濕原理，即將干燥空氣強制循環于物料間，使其含水量逐漸減少以達到干燥的目的。低溫低濕空氣在強制循環中不斷吸收物料表面水分，達到飽和狀態的空氣經過蒸發器被降溫并析出，析出的水分由集水盤排出庫體，達到循環干燥的目的。冷風干燥設備運行費用低，易于控制，干燥溫度為中低溫(5-50°C )，對微生物菌體損傷小。
[0076]在本發明中，在溫度為5?15°C的條件下進行冷風干燥4?5h。冷風干燥所使用的設備例如是由湖北歐勝電器有限公司以商品名冷風干燥機銷售的產品。
[0077]本發明還涉及采用所述制備方法制備得到的高活性粉狀畢赤酵母菌粉。
[0078]根據農用微生物菌劑(GB20287-2006)標準分析方法測定，所述粉狀畢赤酵母粉的有效活菌數CFU ^ 60.0億/g ；雜菌率蘭10.0 % ;
[0079]根據農用微生物菌劑(GB20287-2006)標準分析方法測定，所述粉狀畢赤酵母粉的水分5.5-7.0% ；
[0080]根據農用微生物菌劑(GB 20287-2006)標準分析方法測定，pH值5.5?6.5;
[0081 ] 根據農用微生物菌劑(GB 20287-2006)標準分析方法測定，在溫度25°C以下保存6個月時菌數保存率3 75 %。
[0082]所述的粉狀畢赤酵母為灰黃色粉末，無潮解結塊。
[0083]所述粉狀畢赤酵母菌粉應該在陰涼、通風、干燥處貯存，本發明高活性粉狀畢赤酵母菌粉的保藏曲線列于附圖3中。由附圖3可以看出溫度越低越有利于粉狀畢赤酵母菌粉的保存，4 °C保存6個月時，菌數保存率為85.7%, 25 °C保存6個月時，菌數保存率為77.8 %，均達到規定指標。
[0084]本發明的粉狀畢赤酵母菌粉主要應用于有機物料腐熟劑的生產和有機肥堆肥發酵;它的使用方法是將該產品與所需發酵的物料充分混勻，調整水分為以重量計35-45%，進行堆堆發酵，溫度超過50°C時要及時補水、翻堆降溫;它的使用量通常是2_4kg每噸物料，或根據需要可適當加大用量。
[0085][有益效果]
[0086]本發明的有益效果是:
[0087]通過粉狀畢赤酵母高密度補料發酵，顯著提高了單位產量約30%，降低了單位成本約20%，設備利用率提高。
[0088]通過復配正交試驗篩選出保護劑和載體的最佳種類及配比，賦予菌體本身最佳保護，從而獲得高活性粉狀畢赤酵母菌粉。
[0089]與傳統離心噴霧干燥生產工藝相比，采用冷風干燥技術干燥溫度較低，更好地保留了生物活性，克服了傳統工藝低活菌、高投入的缺點，具有廣闊的市場前景。
【【附圖說明】】
[0090]圖1是實施例1粉狀畢赤酵母高密度補料發酵與pH控制時與對比實施例1不補料和不控制pH時OD6qqim隨發酵時間而變化的示意圖；
[0091]圖2是實施例2使用復合保護劑和載體與對比實施例2使用單一載體和保護劑對粉狀畢赤酵母菌體存活率影響示意圖。
[0092 ]圖3是本發明高活性粉狀畢赤酵母菌粉的保藏曲線。
【【具體實施方式】】
[0093]通過下述實施例將能夠更好地理解本發明。
[0094]實施例1:粉狀畢赤酵母高活性菌粉的制備
[0095]該實施例的實施步驟如下:
[0096]A、活化培養
[0097]制備麥芽汁液體培養基:按照大麥芽與水的重量比1:4，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度58°C下進行糖化3.8h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.5kg/cm2下滅菌40min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到麥芽汁液體培養基；
[0098]用無菌吸管吸取0.3mL上述麥芽汁液體培養基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養基中，在溫度26°C下活化培養2d;
[0099]按照以YPD培養基重量計3%接種量，將活化培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于Yro培養基斜面上，在溫度26 °C下斜面培養2d ；
[0100]B、一級種子培養
[0101]使用接種環挑取一環斜面培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于60mLYPD液體培養基中，在溫度28 °C與轉速220rad/min條件下振蕩培養，直到培養液OD6qqim達到12.0時得到一級種子液；
[0102]C、制備高密度液體發酵培養基
[0103]將2重量份葡萄糖、0.5重量份蛋白胨、0.5重量份磷酸二氫鉀、0.01重量份硫酸鎂、0.03重量份硫酸亞鐵、0.06重量份硫酸錳與補充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.12MPa與溫度125°C的條件下滅菌18min，接著使用濃度為以體積計26%的氨水將其pH值調節至5.4，得到一種高密度液體發酵培養基；
[0104]D、發酵培養
[0105]按照以液體發酵培養基重量計6%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發酵培養基中，在培養溫度30 °C、初始pH 5.5、壓力0.03MPa、轉速300rad/min與通氣比1:1.0的條件下進行發酵培養;與此同時，通過通氣比、壓力與轉速調整，將整個發酵過程中溶解氧DO控制在3 20 %，通過滴加濃度為以體積計26 %的氨水將在整個發酵過程中發酵培養液的pH值控制在5.5 ；
[0106]E、補料
[0107]在整個發酵培養過程中，在通氣量、壓力與轉速不變時，如果溶解氧DO在Imin內升高30%以上時，需要按照發酵培養基體積計18%的添加量往發酵培養液中添加補料培養基;所述的補料培養基由42重量份葡萄糖與8重量份硫酸鎂組成，在蒸汽壓力102kPa與溫度110 °C的條件下滅菌22min，在整個發酵培養過程中添加9次所述的補料培養基。整個發酵培養時間為44h。
[0108]F、添加輔料
[0109]在發酵培養結束前0.5h，按照發酵培養基體積計I %的添加量添加甘露醇保護劑，4%的添加量添加吐溫80，充分混勻；接著在離心轉速2600rpm的條件下離心濃縮2倍;再按照發酵培養基體積計20%的添加量添加粒度100?150目米糠、24%的添加量添加加益粉，充分混勻，接著輸送至冷風干燥機中在溫度為5?15°C的條件下進行冷風干燥4h，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。
[0110]根據本說明書描述的方法測定所述粉狀畢赤酵母粉的有效活菌數CFU為60.0億/g;雜菌率蘭10.0 % ;水分5.5%； pH值5.5;在溫度25°C以下保存6個月時菌數保存率3 75%。
[0111]本實施例制備的粉狀畢赤酵母為灰黃色粉末，無潮解結塊。
[0112]實施例2:粉狀畢赤酵母高活性菌粉的制備
[0113]該實施例的實施步驟如下:
[0114]A、活化培養
[0115]制備麥芽汁液體培養基:按照大麥芽與水的重量比1:3，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度55°C下進行糖化4.5h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.6kg/cm2下滅菌38min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到麥芽汁液體培養基；
[0116]用無菌吸管吸取0.5mL上述麥芽汁液體培養基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養基中，在溫度30°C下活化培養2d;
[0117]按照以YPD培養基重量計4%接種量，將活化培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于Yro培養基斜面上，在溫度30 °C下斜面培養2.5d ；
[0118]B、一級種子培養
[0119]使用接種環挑取一環斜面培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于50mLYPD液體培養基中，在溫度30°C與轉速200rad/min條件下振蕩培養，直到培養液OD6qqim達到15.0時得到一級種子液；
[0120]C、制備高密度液體發酵培養基
[0121 ]將I重量份葡萄糖、1.5重量份蛋白胨、0.1重量份磷酸二氫鉀、0.04重量份硫酸鎂、0.06重量份硫酸亞鐵、0.03重量份硫酸錳與補充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.1lMPa與溫度123°C的條件下滅菌20min，接著使用濃度為以體積計24%的氨水將其pH值調節至5.0，得到一種高密度液體發酵培養基；
[0122]D、發酵培養
[0123]按照以液體發酵培養基重量計8%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發酵培養基中，在培養溫度28 °C、初始pH 5.5、壓力0.06MPa、轉速200rad/min與通氣比I: 2.5的條件下進行發酵培養;與此同時，通過通氣比、壓力與轉速調整，將整個發酵過程中溶解氧DO控制在3 20%，通過滴加濃度為以體積計24%的氨水將在整個發酵過程中發酵培養液的pH值控制在6.0 ；
[0124]E、補料
[0125]在整個發酵培養過程中，在通氣量、壓力與轉速不變時，如果溶解氧DO在Imin內升高30%以上時，需要按照發酵培養基體積計22%的添加量往發酵培養液中添加補料培養基;所述的補料培養基由35重量份葡萄糖與5重量份硫酸鎂組成，在蒸汽壓力104kPa與溫度114°C的條件下滅菌18min，在整個發酵培養過程中添加8次所述的補料培養基。整個發酵培養時間為36h;
[0126]F、添加輔料
[0127]在發酵培養結束前1.0h，按照發酵培養基體積計3 %的添加量添加甘露醇保護劑，2%的添加量添加吐溫80，充分混勻；接著在離心轉速2000rpm的條件下離心濃縮3倍;再按照發酵培養基體積計30%的添加量添加粒度100?150目米糠、20%的添加量添加加益粉，充分混勻，接著輸送至冷風干燥機中在溫度為5?15°C的條件下進行冷風干燥5h，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。
[0128]根據本說明書描述的方法測定所述粉狀畢赤酵母粉的有效活菌數CFU為62.2億/g;雜菌率蘭10.0 % ;水分7.0%； pH值6.5;在溫度25°C以下保存6個月時菌數保存率蘭75%。
[0129]本實施例制備的粉狀畢赤酵母為灰黃色粉末，無潮解結塊。
[0130]實施例3:粉狀畢赤酵母高活性菌粉的制備[0131 ]該實施例的實施步驟如下:
[0132]A、活化培養
[0133]制備麥芽汁液體培養基:按照大麥芽與水的重量比1:5，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度60°C下進行糖化3.5h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.7kg/cm2下滅菌40min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到麥芽汁液體培養基；
[0134]用無菌吸管吸取0.4mL上述麥芽汁液體培養基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養基中，在溫度28°C下活化培養3d;
[0135]按照以YPD培養基重量計5%接種量，將活化培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于Yro培養基斜面上，在溫度28 °C下斜面培養3d ；
[0136]B、一級種子培養
[0137]使用接種環挑取一環斜面培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于70mLYPD液體培養基中，在溫度32 °C與轉速250rad/min條件下振蕩培養，直到培養液OD6qqim達到13.0時得到一級種子液；
[0138]C、制備高密度液體發酵培養基
[0139]將3重量份葡萄糖、1.2重量份蛋白胨、0.2重量份磷酸二氫鉀、0.05重量份硫酸鎂、0.05重量份硫酸亞鐵、0.04重量份硫酸錳與補充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.15MPa與溫度121°C的條件下滅菌22min，接著使用濃度為以體積計22%的氨水將其pH值調節至6.0，得到一種高密度液體發酵培養基；
[0140]D、發酵培養
[0141]按照以液體發酵培養基重量計10%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發酵培養基中，在培養溫度32 °C、初始pH 5.5、壓力0.04MPa、轉速350rad/min與通氣比1:1.6的條件下進行發酵培養;與此同時，通過通氣比、壓力與轉速調整，將整個發酵過程中溶解氧DO控制在3 20%，通過滴加濃度為以體積計22%的氨水將在整個發酵過程中發酵培養液的pH值控制在6.5 ；
[0142]E、補料
[0143]在整個發酵培養過程中，在通氣量、壓力與轉速不變時，如果溶解氧DO在Imin內升高30%以上時，需要按照發酵培養基體積計20%的添加量往發酵培養液中添加補料培養基;所述的補料培養基由45重量份葡萄糖與12重量份硫酸鎂組成，在蒸汽壓力102kPa與溫度117 °C的條件下滅菌20min，在整個發酵培養過程中添加10次所述的補料培養基。整個發酵培養時間為40h ；
[0144]F、添加輔料
[0145]在發酵培養結束前0.8h，按照發酵培養基體積計2 %的添加量添加甘露醇保護劑，
6%的添加量添加吐溫80，充分混勾；接著在離心轉速4000rpm的條件下離心濃縮4倍;再按照發酵培養基體積計28%的添加量添加粒度100?150目米糠、30%的添加量添加加益粉，充分混勻，接著輸送至冷風干燥機中在溫度為5?15°C的條件下進行冷風干燥4h，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。
[0146]根據本說明書描述的方法測定所述粉狀畢赤酵母粉的有效活菌數CFU為64.4億/g;雜菌率蘭10.0 % ;水分5.8%； pH值6.0;在溫度25°C以下保存6個月時菌數保存率3 75%。
[0147]本實施例制備的粉狀畢赤酵母為灰黃色粉末，無潮解結塊。
[0148]實施例4:粉狀畢赤酵母高活性菌粉的制備
[0149]該實施例的實施步驟如下:
[0150]A、活化培養
[0151]制備麥芽汁液體培養基:按照大麥芽與水的重量比1:4，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度56°C下進行糖化4.0h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.6kg/cm2下滅菌42min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到麥芽汁液體培養基；
[0152]用無菌吸管吸取0.4mL上述麥芽汁液體培養基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養基中，在溫度26°C下活化培養3d;
[0153]按照以YPD培養基重量計4%接種量，將活化培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于Yro培養基斜面上，在溫度28 °C下斜面培養2.5d ；
[0154]B、一級種子培養
[0155]使用接種環挑取一環斜面培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于80mLYPD液體培養基中，在溫度30 °C與轉速230rad/min條件下振蕩培養，直到培養液OD6qqim達到14.0時得到一級種子液；
[0156]C、制備高密度液體發酵培養基
[0157]將2重量份葡萄糖、0.8重量份蛋白胨、0.4重量份磷酸二氫鉀、0.03重量份硫酸鎂、0.04重量份硫酸亞鐵、0.05重量份硫酸錳與補充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.14MPa與溫度124°C的條件下滅菌20min，接著使用濃度為以體積計28%的氨水將其pH值調節至6.0，得到一種高密度液體發酵培養基；
[0158]D、發酵培養
[0159]按照以液體發酵培養基重量計8%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發酵培養基中，在培養溫度30 °C、初始pH 5.5、壓力0.05MPa、轉速250作(1/1]1；[11與通氣比1:2.0的條件下進行發酵培養;與此同時，通過通氣比、壓力與轉速調整，將整個發酵過程中溶解氧DO控制在3 20%，通過滴加濃度為以體積計28%的氨水將在整個發酵過程中發酵培養液的pH值控制在6.2 ；
[0160]E、補料
[0161]在整個發酵培養過程中，在通氣量、壓力與轉速不變時，如果溶解氧DO在Imin內升高30%以上時，需要按照發酵培養基體積計20%的添加量往發酵培養液中添加補料培養基;所述的補料培養基由38重量份葡萄糖與15重量份硫酸鎂組成，在蒸汽壓力104kPa與溫度116°c的條件下滅菌20min，在整個發酵培養過程中添加9次所述的補料培養基。整個發酵培養時間為48h;
[0162]F、添加輔料
[0163]在發酵培養結束前0.5h，按照發酵培養基體積計2 %的添加量添加甘露醇保護劑，5%的添加量添加吐溫80，充分混勻；接著在離心轉速3400rpm的條件下離心濃縮3倍;再按照發酵培養基體積計24%的添加量添加粒度100?150目米糠、28%的添加量添加加益粉，充分混勻，接著輸送至冷風干燥機中在溫度為5?15°C的條件下進行冷風干燥5h，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。
[0164]根據本說明書描述的方法測定所述粉狀畢赤酵母粉的有效活菌數CFU為61.2億/g;雜菌率蘭10.0 % ;水分6.6%； pH值5.9;在溫度25°C以下保存6個月時菌數保存率3 75%。
[0165]本實施例制備的粉狀畢赤酵母為灰黃色粉末，無潮解結塊。
[0166]對比實施例1:
[0167]該對比實施例按照與實施例1相同的方式進行，只是不添加本發明補料培養基，也不控制在整個發酵過程中發酵培養液的pH值。
[0168]實施例1與對比實施例1的OD6qqim隨發酵時間而改變的情況列于圖1中。
[0169]附圖1的結果非常清楚地顯示，通過粉狀畢赤酵母高密度補料發酵，顯著提高了發酵液的單位產量，單位產量提高30.4%，降低了單位成本，單位成本降低19.2%，設備利用率提尚O
[0170]對比實施例2:
[0171]該對比實施例按照與實施例2相同的方式進行，只是使用甘露醇、吐溫80單一保護劑，使用米糠、加益粉單一載體。
[0172]實施例2與對比實施例2使用不同保護劑與載體對粉狀畢赤酵母菌體存活率影響列于附圖2中。
[0173]附圖2的結果非常明顯地顯示，在選用單一保護劑和單一載體時，粉狀畢赤酵母的存活率明顯低于通過正交試驗篩選出的最佳種類及配比的保護劑和載體。由此說明，復合保護劑和載體賦予了菌體本身最佳保護，從而獲得了高活性粉狀畢赤酵母菌粉。
【主權項】
1.一種粉狀畢赤酵母高活性菌粉的制備方法，其特征在于該制備方法的步驟如下: A、活化培養 用無菌吸管吸取0.3?0.5mL麥芽汁液體培養基，滴入裝有凍干的粉狀畢赤酵母ACCC20136的安瓿內，輕輕振蕩，使其溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，放于IL麥芽汁培養基中，在溫度26?30°C下活化培養2?3d; 按照以YB)培養基重量計3?5%接種量，將活化培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136接種于YI3D培養基斜面上，在溫度26?30 °C下斜面培養2?3d; B、一級種子培養 使用接種環挑取一環斜面培養的粉狀畢赤酵母ACCC20136，接種于50?80mL YPD液體培養基中，在溫度28?32 °C與轉速200?250rad/min條件下振蕩培養，直到培養液OD6(X)r?達到12.0?15.0時得到一級種子液； C、制備高密度液體發酵培養基 將I?3重量份葡萄糖、0.5?1.5重量份蛋白胨、0.1?0.5重量份磷酸二氫鉀、0.01?0.05重量份硫酸鎂、0.03?0.06重量份硫酸亞鐵、0.03?0.06重量份硫酸錳與補充至1000重量份蒸餾水混合均勻，然后在壓力0.11?0.1510^與溫度121°(:?125°(:的條件下滅菌18?22min，接著使用濃度為以體積計22?28%的氨水將其pH值調節至5.0?6.0，得到一種高密度液體發酵培養基； D、發酵培養 按照以液體發酵培養基重量計6?10%的接種量，將步驟B得到的種子液接種于在步驟C得到的高密度液體發酵培養基中，在培養溫度2 8?3 2 °C、初始P H 5.5、壓力0.0 3?0.06MPa、轉速200?350rad/min與通氣比1:1?2.5的條件下進行發酵培養;與此同時，通過通氣比、壓力與轉速調整，將整個發酵過程中溶解氧DO控制在320%，通過滴加濃度為以體積計22?28%的氨水將在整個發酵過程中發酵培養液的pH值控制在5.5?6.5; E、補料 在整個發酵培養過程中，在通氣量、壓力與轉速不變時，如果溶解氧DO在Imin內升高30 %以上時，需要按照發酵培養基體積計18?22 %的添加量，往發酵培養液中添加由35?45重量份葡萄糖與5?15重量份硫酸鎂組成的補料培養基； F、添加輔料 在發酵培養結束前0.5?lh，按照發酵培養基體積計I?3%的添加量添加甘露醇保護劑與2?6%的添加量添加吐溫80，充分混勻;接著在離心轉速2000?4000rpm的條件下離心濃縮2?4倍;再按照發酵培養基體積計20?30 %的添加量添加米糠載體、20?30 %的添加量添加加益粉載體，充分混勻，接著輸送至冷風干燥機中進行冷風干燥，得到粉狀畢赤酵母高活性菌粉。2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟A中，在按照大麥芽與水的重量比1:3?5，把水加到大麥芽中，攪拌混合均勻，然后放于保溫箱中在溫度55?600C下進行糖化3.5?4.5h，過濾，得到的糖化麥芽汁在壓力0.5?0.7kg/cm2下滅菌38?42min，接著用水將滅菌的糖化麥芽汁稀釋至糖度為12波美度，得到一種麥芽汁液體培養基。3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟C與步驟D中，所述的氨水濃度是以體積計22?28 %。4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟C中，高密度液體發酵培養基由2重量份葡萄糖、I重量份蛋白胨、0.3重量份磷酸二氫鉀、0.03重量份硫酸鎂、0.05重量份硫酸亞鐵、0.05重量份硫酸猛與補充至1000重量份蒸饋水組成。5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟E中，所述的補料培養基在蒸汽壓力102?104kPa與溫度110?117°C的條件下滅菌18?22min。6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟E中，在整個發酵培養過程中添加8?10次所述的補料培養基。7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于整個發酵培養時間是36?48h。8.根據權利要求1所述的高活性菌粉，其特征在于在步驟F中，在溫度為5?15°C的條件下進行冷風干燥4?5h。9.根據權利要求1所述的高活性菌粉，其特征在于在步驟F中，所述的米糠載體粒度是100?150目。10.根據權利要求1所述制備方法制備得到的高活性粉狀畢赤酵母菌粉，其特征在于粉狀畢赤酵母有效活菌數CFU ^ 60.0億/g ；雜菌率= 10.0%;水分5.5-7.0%; pH值5.5?6.5;在溫度25°C以下保存6個月時菌數保存率375%。
【文檔編號】C12N1/16GK105925495SQ201610564272
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月18日
【發明人】趙躍進, 趙躍文, 趙躍民, 易卿, 杜亞楠, 趙潔, 趙科, 謝松, 張盼, 任寸娟, 秦中輝, 趙九生
【申請人】三門峽龍飛生物工程有限公司