一種重組解脂亞羅酵母ccfm-ju277-9菌株全細胞催化劑的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種重組解脂亞羅酵母CCFM?JU277?9菌株全細胞催化劑的制備方法，該方法包括確定菌體收集時間、確定培養基中油酸濃度、確定培養細胞時間與透性化處理等步驟。本發明方法通過表面活性劑與凍融處理能夠增加細胞壁和細胞膜的通透性，減少膜對底物和產物的傳質阻力，提高脂肪酸底物和產物進出菌體的速率，從而顯著提高重組解脂亞羅酵母全細胞催化生成t10,c12?CLA的轉化效率，非常明顯地提高t10,c12?CLA的產量。
【專利說明】-種重組解脂亞羅酵母CCFM-JU2^-9菌株全細胞催化劑的制 備方法 【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域。更具體地，本發明設及一種重組解脂亞羅酵母 CCFM-JU277-9菌株全細胞催化劑的制備方法。 【【背景技術】】
[0002] 共輛亞油酸（conjugated Iinoleic acid,CLA)是具有共輛雙鍵的十八碳二締酸 的統稱，在7與9位、8與10位、9與11位、10與12位、11與13位或12與14位碳原子為順式或反式 共輛雙鍵。其中反10,順12-共輛亞油酸(tlO，cl2-CLA)是最重要的活性單體之一，主要具有 抗癌生理活性及減少人類脂肪細胞中甘油=醋積累的功效。
[0003] 來源于瘦瘡丙酸桿菌（91'〇9：[011化日(31日1'；[11111日(3]1日3)的亞油酸異構酶。41)作用于 (c9，cl2-LA)亞油酸分子的C9雙鍵，生成高度專一的tlO，cl2-CLA單體。本實驗室將PAI在解 脂耶氏酵母細胞內成功重組表達，并證明該重組菌株是適合tlO，cl2-CLA合成的微生物系 統。全細胞催化擁具有許多優勢，例如能為酶反應提供穩定環境、高效、可多批次轉化、產物 易分離、易控制等。利用完整的重組解脂耶氏酵母細胞作為催化劑，外源添加底物c9，cl2- LA，全細胞催化合成tlO，cl2-CLA。但是，重組解脂耶氏酵母細胞壁和細胞膜成為影響底物 c9，cl2-LA進入細胞內與酶PAI接觸，生成產物tlO，cl2-CLA高效輸出的主要因素。增加細胞 壁和細胞膜的通透性，可促進底物進入細胞內與酶接觸并迅速催化反應，從而提高產物的 合成效率，縮短整個全細胞催化反應時間，具體反應過程參見附圖1。
[0004] 目前，關于〇9，(：12-1^\、*10，(312-化4^及其它脂肪酸在解脂耶氏酵母中的運輸機 制還存在爭議，可能是簡單擴散、促進擴散或二者同時存在。解脂耶氏酵母能夠W疏水性物 質為唯一碳源生長繁殖，并偏好利用油酸。當其在含油酸的培養基中生長繁殖，細胞表面會 發生改變，形成突起;壁膜間隙擴大，利于脂肪酸進出菌體;而且形態和生理都發生改變，更 加適合在含疏水性物質的環境中生存。
[0005] 通過添加透性化試劑(常用表面活性劑、有機溶劑、馨合劑等）、物理方法(滲透壓、 凍融、超聲等)或分子生物學方法(細胞壁合成相關基因突變、底物和產物載體蛋白改變)改 善細胞膜的通透性，減少膜對底物和產物的傳質阻力，提高全細胞催化效率。D.Galabova等 人在Permeabilization of Yarrowia Iipolytica cells by Triton X-100[J] .Enzyme and Microbial Technology, 1996,18(1) :18-22中描述了利用曲控通X-IOO處理解脂耶氏 酵母細胞，制得合適的透性化細胞；Daniela Zehentgruber等人在Qiallenges of steroid biotransformation with human cytochrome P450 monooxygenase CYP21 using resting cells of recombinant Schizosaccharomycespombe[J]. Journal of biotechnology ,2010,146(4) :179-185中說明了利用吐溫80處理裂殖酵母用于全細胞催 化，提高了轉化效率；Daniela Vieira Coi'tez等人在CTAB,Triton X-IOO and freezing? thawing treatments of Candida gui11iermondii:Effects on permeability and accessibility of the glucose-6-phosphate dehydrogenase,xylose reductase and xylitol dehy 化 Ogenase enzymes[J].化 W biotechnology.2012,29(2) :192-198 中描述了 添加 CTAB和曲拉通XlOO,反復凍融法處理高里念珠菌，得到目標透性化細胞。
[0006] 關于全細胞催化合成單一的tlO,cl2-CLA文獻報道較少，Xihong化等人在化ast cell surf曰Ce display of Iinoleic acid isomer曰se from Propionib曰cterium 曰cnes 曰nd its 曰pplic曰tion for the production of tr曰ns-10,cis-12conjug曰ted Iinoleic acid[J].Biotechnology and applied biochemistry, 2015,62(1) :1-8 中描述了將亞油酸 異構酶(PAI)在釀酒酵母中成功異源表達，使PAI定位在細胞表面，添加外源c9，cl2-LA為底 物，全細胞催化20h，優化了反應條件，但至少獲得25.4mg/L的tlO，C12-CLA產量。
[0007] 針對現有技術存在的運些技術缺陷，本發明人通過大量實驗研究與分析，終于研 制出一種新的重組解脂耶氏酵母全細胞催化劑制備方法。 【
【發明內容】
】
[0008] [要解決的技術問題]
[0009] 本發明的目的是提供一種重組解脂亞羅酵母菌株CCFM-JU277-9全細胞催化劑的 制備方法。
[0010] [技術方案]
[0011] 本發明是通過下述技術方案實現的。
[001。 本發明設及一種重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株全細胞催化劑的制備方法。
[0013] 所述制備方法的步驟如下：
[0014] A、確定菌體收集時間
[0015] 在溫度-80°C下保存的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株在YN抓平板培養基中 在溫度28 °C下活化培養4~5天，再在YNB的夜體種子培養基中在溫度28 °C與轉速20化pm的條 件下搖床種子培養48h;得到的種子培養液接種于分別含有0.0~10.0 g/L油酸的YTO液體培 養基中進行培養，其中，添加的油酸代替YTO液體培養基中對應濃度的葡萄糖，使各組培養 基中的碳元素含量保持一致。同時在不同的培養時間取樣，樣品經洗涂、干燥，稱量并由下 式計算得到菌體干重：
[0016] 菌體干重(g/L)=凍干菌體重量(g)/培養體系體積化）；
[0017] W培養時間為橫坐標，W菌體干重為縱坐標繪制生長曲線，由所述生長曲線確定 收集菌體時間為36h;
[001引B、確定培養基中油酸濃度
[0019]將在含有0.0~10.0 g/L油酸的YPD液體培養基中培養3化的重組解脂亞羅酵母 CCFM-JU277-9菌株培養液，在溫度4°C與轉速8000r/min的條件下離屯、lOmin，并用滅菌生理 鹽水洗涂2次，收集酵母菌體，重懸于憐酸鹽緩沖液中，使其濕菌體終濃度為lOOg/L，再添加 底物c9，cl2-LA，在轉速200rpm、溫度28°C與pH 6.8的條件下進行催化反應2地，根據*10， C12-LA產量確定在培養基中的油酸濃度為5. Og/L;
[0020] C、確定培養細胞時間
[0021] 重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株在含有5g/L油酸的Yro培養基中進行培養， 收集培養時間為32、36和40h的菌體，轉移至20ml憐酸鹽緩沖液中，再添加底物c9，cl2-LA， 在溫度28°C下進行全細胞催化反應24h，將tlO，cl2-CLA產量最高的培養時間確定為培養細 胞時間；
[0022] D、透性化處理
[0023] 在根據步驟A-C確定的條件下，重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株在含有5g/L 油酸的YPD培養基中進行培養36h，收集培養時間為36h的菌體，重組解脂亞羅酵母CCFM- JU277-9菌株全細胞轉移至20ml憐酸鹽緩沖液中，將全細胞濕重調節至lOOg/L，再加入W體 積計0.5 %~3.0 %吐溫80，在搖床中在溫度28°C與20化pm的條件下處理化，于是得到能夠 提高tlO，C12-CLA產量的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化劑。
[0024] 根據本發明的一種優選實施方式，重組解脂亞羅酵母菌株CCFM-JU277-9保藏于在 北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中屯、，其保藏號為CGMCC No.7284。
[0025] 根據本發明的另一種優選實施方式，在步驟A中，所述的YPD液體培養基不含油酸 時，它是含有20g/L葡萄糖、lOg/L酵母提取物與20g/L膜蛋白腺的pH為6.8的培養基，該培養 基在溫度115°C下滅菌20min;所述的YPD液體培養基含有油酸時，只是使用油酸替代所述 YTO液體培養基中的葡萄糖，使它們含有的碳元素含量保持一致，其它不變。
[0026] 根據本發明的另一種優選實施方式，所述的YNBD液體種子培養基是含有20g/L葡 萄糖、1.7g/L無氨基酸無硫酸錠酵母氮源與5g/L硫酸錠的抑為5.5的培養基，該培養基在溫 度115°C下滅菌20min。
[0027] 根據本發明的另一種優選實施方式，所述的YNBD固體種子培養基是含有20g/L葡 萄糖、1.7g/L無氨基酸無硫酸錠酵母氮源、5g/L硫酸錠與20g/L瓊脂粉的抑為5.5的培養基， 該培養基在溫度115°C下滅菌20min。
[0028] 根據本發明的另一種優選實施方式，在步驟B與D中，所述的憐酸鹽緩沖液是濃度 為50mM、pH 6.8的由憐酸氨二鋼與憐酸二氨鐘組成的緩沖液。
[0029] 根據本發明的另一種優選實施方式，在步驟B中，所述的產量是Wg/L計tl0，cl2- CLA產量與W g/L計菌體干重的比值。
[0030] 根據本發明的另一種優選實施方式，所述的Wg/L計tlO，cl2-CLA產量是重組解脂 亞羅酵母菌株CCFM-JU277-9全細胞催化反應生成的在細胞內和細胞外的Wg計tlO，cl2- CLA總質量與WL計反應體系體積的比值。
[0031] 根據本發明的另一種優選實施方式，重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株全細胞 轉移至20ml憐酸鹽緩沖液中，將全細胞濕重調節至lOOg/L，接著采用液氮速凍30s，然后在 溫度28°C的水浴中解凍4.5~5.5min，重復凍融1~5次，于是得到能夠提高tlO，C12-CLA產 量的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化劑。
[0032] 下面將更詳細地描述本發明。
[0033] 本發明設及一種重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株全細胞催化劑的制備方法。 本發明方法首先確定收集菌體的時間，再確定油酸濃度，接著進一步確定培養時間，最后確 定透性化處理方法。
[0034] 本發明制備方法的步驟如下：
[0035] 所述制備方法的步驟如下：
[0036] A、確定菌體收集時間
[0037] 在溫度-80°C下保存的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株在YN抓平板培養基中 在溫度28 °C下活化培養4~5天，再在YNB的夜體種子培養基中在溫度28 °C與轉速20化pm的條 件下搖床種子培養48h;得到的種子培養液接種于分別含有0.0~10.0 g/L油酸的YTO液體培 養基中進行培養，其中，添加的油酸代替YTO液體培養基中對應濃度的葡萄糖，使各組培養 基中的碳元素含量保持一致，同時在不同的培養時間取樣，樣品經洗涂、干燥，稱量并由下 式計算得到菌體干重：
[0038] 菌體干重(g/L)=凍干菌體重量(g)/培養體系體積化）；
[0039] W培養時間為橫坐標，W菌體干重為縱坐標繪制生長曲線，進入穩定期的時間都 在36h，由所述生長曲線確定收集菌體時間為36h。
[0040] 本發明使用的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株保藏于在北京市朝陽區北辰 西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、， 其保藏號為CGMCC No.7284dCN103233036A、申請號為CN 201310120175.1的中國發明專利 申請公開了該菌株。在有些文獻中，該菌株也可能被記載為重組耶氏解脂酵母CCFM-JU277- 9。
[0041] 在運個步驟中，所述的YNB的夜體種子培養基是含有20g/L葡萄糖、1.7g/L無氨基酸 無硫酸錠酵母氮源與5g/L硫酸錠的抑為5.5的培養基，該培養基在溫度115°C下滅菌20min。
[0042] 所述的YN抓固體種子培養基是含有20g/L葡萄糖、1.7g/L無氨基酸無硫酸錠酵母 氮源、5g/L硫酸錠與20g/L瓊脂粉的pH為5.5的培養基，該培養基在溫度115°(：下滅菌2〇111^。
[0043] 所述的YTO液體培養基不含油酸(O.Og/L油酸)時，它是含有20g/L葡萄糖、lOg/L酵 母提取物與20g/L膜蛋白腺的pH為6.8的培養基，該培養基在溫度115°C下滅菌20min。
[0044] 所述的YTO液體培養基含有油酸時，它只是使用油酸替代所述YTO液體培養基中的 葡萄糖，使它們含有的碳元素含量保持一致，其它不變。
[0045] 在本發明中，在不同的培養時間采取的樣品在溫度4°C與轉速8000r/min的條件下 離屯、lOmin，收集的菌體用生理鹽水洗涂兩次，然后在目前市場上銷售的真空干燥設備中在 溫度-l〇°C與壓力10化的條件下進行真空冷凍干燥，稱量并由下式計算得到菌體干重：
[0046] 菌體干重(g/L)=凍干菌體重量(g)/培養體系體積化）
[0047] 重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株在含不同濃度油酸培養基中的生長曲線列 于圖2中，圖中A是不含油酸的生長曲線;B是含O.lg/L油酸的生長曲線;C是含0.5g/L油酸的 生長曲線;D是含1. Og/L油酸的生長曲線;E是含5. Og/L油酸的生長曲線;F是含10.0 g/L油酸 的生長曲線。
[004引B、確定培養基中油酸濃度
[0049] 將在含有0.0~10.0 g/L油酸的YPD液體培養基中培養36h的重組解脂亞羅酵母 CCFM-JU277-9菌株培養液，在溫度4°C與8000r/min的條件下離屯、lOmin，并用滅菌生理鹽水 洗涂2次，收集酵母菌體，重懸于憐酸鹽緩沖液中，使其濕菌體終濃度為lOOg/L，再添加底物 c9，cl2-LA，在轉速200rpm、溫度28°C與pH 6.8的條件下進行催化反應2地，根據110，。12-1^\ 產量確定在培養基中的油酸濃度為5. Og/L;
[0050] 所述的憐酸鹽緩沖液是濃度為50mM、pH 6.8的由憐酸氨二鋼與憐酸二氨鐘組成的 緩沖液。
[00引]具體地，收集重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9分別在0.0、0.1、0.5、1.0、5.0、 10.0 g/L油酸培養基中培養36h得到的培養液，在溫度4°C與轉速SOOOrpm的條件下離屯、 lOmin，收集菌體用滅菌生理鹽水洗涂2次，收集其菌泥作為全細胞催化劑。然后將全細胞催 化劑轉移到所述的憐酸鹽緩沖液中，再添加底物c9，cl2-LA，在溫度28°C下進行重組解脂亞 羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化反應2地。不同濃度油酸培養重組解脂亞羅酵母全細胞催 化合成tlO，cl2-CLA的產量試驗結果列于圖3。通過運組實驗確定，含5.0g/L油酸的培養基 培養得到的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌體，用于全細胞催化反應的tl0，cl2-化A產 量最高，達到1.34g/g。其余組產量由高到低分別為含l.Og/L油酸組1.27g/g、含lO.Og/L油 酸組1.05g/g、不含油酸組0.96g/g、含0.5g/L油酸組0.95g/g、含0.1 g/L油酸組0.70g/g。確 定油酸濃度為5g/L。
[0052]在本發明中，所述的產量應該理解是Wg/L計tlO，cl2-CLA產量與Wg/L計菌體干 重的比值。
[0053] 所述的Wg/L計tl0，cl2-化A產量是重組解脂亞羅酵母菌株CCFM-JU277-9全細胞 催化反應生成的在細胞內和細胞外的W g計110，C12-CLA總質量與W L計反應體系體積的比 值。
[0054] 洗涂菌體進行真空冷凍干燥，稱量菌體干總重。從菌體干總重減去胞內脂質總量 得到無脂質生物量。
[0055] 將離屯、分離上清與2次洗涂上清液合并得到一種轉化液，它再進行細胞外脂肪酸 測定與分析。
[0056] 細胞外脂肪酸分析如下：
[0化7] 取10化L轉化液加到5ml干凈玻璃瓶中，同時加入50化十屯燒酸脂肪酸內標和ImL 10%鹽酸甲醇溶液，在溫度50°C水浴中保溫化，接著冷卻至室溫，再加入ImL正己燒和1血飽 和氯化鋼溶液，劇烈振蕩30s，在轉速3000r/min下離屯、3min，移取上層溶液。再往沉淀物中 加入ImL正己燒再次萃取，兩次萃取液合并，用氮氣吹干，然后加入ImL正己燒，振蕩混勻，轉 入氣相瓶進行高效氣相色譜定性、定量分析，計算在細胞外的產物tlO，cl2-CLA含量。
[005引細胞內脂肪酸分析如下：
[0059] 稱取20~25mg真空冷凍干燥的菌體于5mL玻璃瓶中，加入SOiiL的十屯燒酸脂肪酸 內標(5mg/ml)、ImL 10%鹽酸甲醇溶液和500化正己燒，在溫度50°C水浴中保溫祉(每半小 時振蕩Imin),接著冷卻至室溫，再加入50化L正己燒和ImL飽和氯化鋼溶液，振蕩混勻，W轉 速3000r/min離屯、分離3min，移取上層溶液，再往沉淀物中加入ImL正己燒再次萃取，兩次萃 取液合并，用氮氣吹干，然后加入ImL正己燒，振蕩混勻，轉入氣相瓶進行高效氣相色譜定 性、定量分析。計算在細胞內的產物tlO，cl2-CLA含量，并計算總脂質含量。
[0060] 所述高效氣相色譜分析的條件如下：
[0061 ]色譜柱為DB-WAX(30mX0.32mm，(p〇.25 |im;Agilent,美國）、氨火焰離子(FID)檢 測器檢測;氮氣為載氣，流量為2mL/min，采用分流方式進樣化L，分流比為15:1，進樣口溫度 為240°C;升溫程序如下：120°C保持3min，W5°C/min升溫速度至190°C，再WrC/min升溫速 度至溫度達到210°C，保持3min。
[0062] 脂肪酸甲醋標準品氣相色譜分析，并通過保留時間對樣品脂肪酸定性;十屯燒酸 甲醋為內標物，通過面積歸一法計算共輛亞油酸的含量，進行定量分析。
[0063] 通過數據處理計算20ml全細胞轉化體系中tlO，cl2-CLA產量：
[0064] tlO，cl2-CLA 產量(g/L) = (細胞內 tlO，cl2-CLA 含量(g)+細胞外 tlO，cl2-CLA 含量 (g))/轉化體系體積化）
[0065] 菌體無脂質生物量(g/L) =(菌體干總重(g)-細胞內脂質總量(g))/轉化體系體積 (L)。
[0066] tlO，cl2-CLA 產量(g/g)=tlO，cl2-CLA 產量(g/L)/菌體無脂質生物量(g/L)
[0067] C、確定培養細胞時間
[0068] 重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株在含有5g/L油酸的Yro培養基中進行培養， 收集培養時間為32、36和40h的菌體，轉移至20ml憐酸鹽緩沖液中，再添加底物c9，cl2-LA， 在溫度28°C下進行全細胞催化反應2地，W細胞增長數目對數為縱坐標，W培養時間為橫坐 標繪制出生長曲線，將tlO，C12-CLA產量最高(達到10.05g/L)的培養時間確定為培養細胞 時間。
[0069] 采用高效氣相色譜分析確定，在其它條件相同的情況下，培養時間為32、36和40h 的全細胞催化反應的110，C12-CLA產量分別是7.21、10.05和9. lOg/L，36h組產量最高，確定 培養時間為36h，具體參見附圖4。
[0070] D、透性化處理
[0071] 在根據步驟A-C確定的條件下，重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株在含有5g/L 油酸的YPD培養基中進行培養36h，收集培養時間為36h的菌體，重組解脂亞羅酵母CCFM- JU277-9菌株全細胞轉移至20ml憐酸鹽緩沖液中，將全細胞濕重調節至lOOg/L，再加入W體 積計0.5 %~3.0 %吐溫80，在搖床中在溫度28°C與20化pm的條件下處理化，于是得到能夠 提高tlO，C12-CLA產量的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化劑。
[0072] 或者，重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株全細胞轉移至20ml憐酸鹽緩沖液中， 將全細胞濕重調節至lOOg/L，接著采用液氮速凍30s，然后在溫度28°C的水浴中解凍4.5~ 5.5111；[]1，重復凍融1~5次，于是得到能夠提高1:10,(312-化4產量的重組解脂亞羅酵母撕尸1- JU277-9全細胞催化劑。
[0073] 在本發明中，重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株全細胞樣品分別采用乳化劑和 液氮凍融兩種方式進行處理。
[0074] 乳化劑處理:使用四種乳化劑，運些乳化劑及其含量分別是W體積計2 %吐溫80、 W體積計2%曲拉通X100、2g/L CTAB與2g/L SDS，在搖床中在溫度28°C與200rpm的條件下 處理化；
[0075] 液氮凍融處理:液氮速凍30s，然后在溫度28°C水浴中解凍5min，重復凍融3次。
[0076] 同時W不添加乳化劑、不液氮凍融處理的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株全 細胞樣品作為對照樣品。W體積計2%吐溫80、W體積計2%曲拉通X100、2g/L CTAB、2g/L SDS與對照樣品進行了同樣試驗，其試驗結果列于附圖5中。
[0077] 對于吐溫80處理:在其它條件相同的情況下，吐溫80濃度分別為W體積計0.5 %、 1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，其試驗結果列于附圖6,運些試驗結果表明，吐溫80最適 濃度為2.0%，tlO，C12-CLA產量達到11.04g/L。
[0078] 對于液氮凍融法處理:在其它條件相同的情況下，用液氮速凍30s，在溫度28°C水 浴中解凍5min，W運種方式重復次1、2、3、4或5次，其試驗結果列于附圖7。運些試驗結果表 明，液氮凍融最佳次數為3次，tlO，C12-CLA產量達到11.44g/L。
[00巧]附圖5-7的試驗結果清楚地表明，對照組的tlO，cl2-CLA產量10.05g/L，吐溫80組 的tlO，cl2-CLA產量為11.04g/L，與其對照組相比提高約Ig/l;曲拉通Xioo組為9.20g/L、 CTAB組為1.29g/L、SDS組為3.63g/L，它們的產量均低于對照組。液氮凍融組為11.44g/L，提 高產量約1.39g/L。由此可見，吐溫80和液氮反復凍融處理能夠提高重組解脂亞羅酵母全細 胞催化合成tlO，cl2-CLA產量。
[0080] 本發明重組解脂亞羅酵母全細胞催化劑制備方法，通過表面活性劑與凍融增加細 胞壁和細胞膜的通透性，減少膜對底物和產物的傳質阻力，提高脂肪酸底物和產物進出菌 體的速率，從而顯著提高重組解脂亞羅酵母全細胞催化生成tlO，cl2-CLA的轉化效率，非常 明顯地提高tlO，cl2-CLA的產量。
[0081] [有益效果]
[0082] 本發明的有益效果是:本發明制備方法通過表面活性劑與凍融增加細胞壁和細胞 膜的通透性，減少膜對底物和產物的傳質阻力，提高脂肪酸底物和產物進出菌體的速率，從 而顯著提高重組解脂亞羅酵母全細胞催化生成tlO，cl2-CLA的轉化效率，非常明顯地提高 tlO，cl2-CLA的產量，現有技術的tlO，cl2-CLA產量為25.4mg/L，而本發明達到llg/LW上， 工藝過程簡單，工藝穩定，適于廣泛推廣使用。 【【附圖說明】】
[0083] 圖1是重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株全細胞催化示意圖；
[0084] 圖2是重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9在含不同濃度油酸培養基中的生長曲線 圖；
[0085] 圖中；
[0086] A-不含油酸；B-含0 . Ig/L油酸；C-含0.5g/L油酸；D-含1. Og/L油酸；E-含 5. Og/L油酸;F-含10.0 g/L油酸；
[0087] 圖3是在不同濃度油酸中培養重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化合成 tl0，cl2-化A的產量示意圖；
[0088] 圖4是不同培養時間對重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化合成tl0，cl2- CLA的影響不意圖；
[0089] 圖5是在不同透性化處理方法處理重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9后，全細胞催 化合成tlO，cl2-CLA的產量圖示意圖；
[0090] 圖6是不同濃度吐溫80對重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化合成tio， C12-化A的影響不意圖；
[0091] 圖7是液氮反復凍融處理不同次數對重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化 合成tlO，cl2-CLA的影響示意圖；
[0092] 圖3-7中：字母a、b、c代表組間差異顯著，P<0.05。 【【具體實施方式】】
[0093] 通過下述實施例將能夠更好地理解本發明。
[0094] 實施例1:本發明全細胞催化劑的制備
[00M] 該實施例的實施步驟如下：
[0096] A、確定菌體收集時間
[0097] 在溫度-80°C下保存的重組解脂亞羅酵母菌株CCFM-JU277-9在YN抓平板培養基中 在溫度28 °C下活化培養4~5天，再在YNB的夜體種子培養基中在溫度28 °C與轉速20化pm的條 件下搖床種子培養4她;得到的種子培養液接種于分別含有0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L油酸 的YTO液體培養基中進行培養，其中，添加的油酸代替YTO液體培養基中對應濃度的葡萄糖， 使各組培養基中的碳元素含量保持一致。同時在不同的培養時間取樣，樣品經洗涂、干燥， 稱量并由下式計算得到菌體干重：
[0098] 菌體干重(g/L)=凍干菌體重量(g)/培養體系體積化）；
[0099] W培養時間為橫坐標，W菌體干重為縱坐標繪制生長曲線，參見附圖2,由所述生 長曲線確定收集菌體時間為36h;
[0100] 所述的YPD液體培養基不含油酸時，它是含有20g/L葡萄糖、lOg/L酵母提取物與 20g/L膜蛋白腺的pH為6.8的培養基，該培養基在溫度115°C下滅菌20min;
[0101 ]所述的YN抓液體種子培養基是含有20g/L葡萄糖、1.7g/L無氨基酸無硫酸錠酵母 氮源與5g/L硫酸錠的pH為5.5的培養基，該培養基在溫度115°C下滅菌20min;
[0102] 所述的YN抓固體種子培養基是含有20g/L葡萄糖、1.7g/L無氨基酸無硫酸錠酵母 氮源、5g/L硫酸錠與20g/L瓊脂粉的pH為5.5的培養基，該培養基在溫度115°C下滅菌20min;
[0103] B、確定培養基中油酸濃度
[0104] 將在含有0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L油酸的YTO液體培養基中培養36h的重組解脂 亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株培養液，收集培養液，在溫度4°C與8000r/min的條件下離屯、 10min，并用滅菌生理鹽水洗涂2次，收集酵母菌細胞，重懸于濃度為50mM、pH6.8的由憐酸 氨二鋼與憐酸二氨鐘組成的緩沖液中，使其濕菌體終濃度為lOOg/L，再添加底物c9，cl2- LA，在轉速20化pm、溫度28°C與抑6.8的條件下進行催化反應24h，根據附圖3的產量示意圖 確定在培養基中的油酸濃度為5. Og/L;
[0105] C、確定培養細胞時間
[0106] 重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株在含有5g/L油酸的YPDO培養基中進行培養， 收集培養時間為32、36和40h的菌體，轉移至20ml濃度為50mM、pH6.8的由憐酸氨二鋼與憐 酸二氨鐘組成的緩沖液憐酸鹽緩沖液中，再添加底物c9，cl2-LA，在溫度28°C下進行全細胞 催化反應24h，W110，C12-CLA產量為縱坐標，W培養時間為橫坐標繪制曲線，參見附圖4，由 此圖確定培養細胞時間為36h;
[0107] D、透性化處理
[0108] 在根據步驟A-C確定的條件下，重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株在含有5g/L 油酸的YPD培養基中進行培養36h，收集培養時間為36h的菌體，重組解脂亞羅酵母CCFM- JU277-9菌株全細胞轉移至20ml憐酸鹽緩沖液中，將全細胞濕重調節至lOOg/L，再加入W體 積計0.5% %吐溫80,在搖床中在溫度28°C與2(K)rpm的條件下處理化，于是得到能夠提高 tlO，C12-CLA產量的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化劑。
[0109] 將重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化劑轉移到由50mM、pH 6.8的由憐酸 氨二鋼與憐酸二氨鐘組成的憐酸鹽緩沖液中，再添加底物c9，cl2-LA，在溫度28°C下進行重 組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化反應2地，根據本申請說明書描述的方法確定， 。10，(312-1^\產量達到11.04邑/1。
[0110] 實施例2:本發明全細胞催化劑的制備
[0111] 該實施例的實施步驟如下：
[0112] 該實施例的實施方式與實施例1的實施方式相同，只是在步驟D透性化處理中添加 W體積計3.0%吐溫80。得到的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化劑立即用于所 述的催化反應。根據本申請說明書描述的方法確定，該實施例的ClO, C12-LA產量達到 12.40g/L〇
[0113] 實施例3:本發明全細胞催化劑的制備
[0114] 該實施例的實施步驟如下：
[0115] 該實施例的實施方式與實施例1的實施方式相同，只是在步驟D透性化處理中添加 W體積計1.8%吐溫80。得到的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化劑立即用于所 述的催化反應。根據本申請說明書描述的方法確定，該實施例的ClO, C12-LA產量達到 11.48g/L〇
[0116] 實施例4:本發明全細胞催化劑的制備
[0117] 該實施例的實施步驟如下：
[0118] 該實施例的實施方式與實施例1的實施方式相同，只是在步驟D透性化處理中采用 液氮速凍30s，然后在溫度28°C的水浴中解凍5.Omin,重復凍融3次。得到的重組解脂亞羅酵 母CCFM-JU277-9全細胞催化劑立即用于所述的催化反應。根據本申請說明書描述的方法確 定，該實施例的ClO，C12-LA產量達到11.24g/L。
[0119] 實施例5:本發明全細胞催化劑的制備
[0120] 該實施例的實施步驟如下：
[0121] 該實施例的實施方式與實施例1的實施方式相同，只是在步驟D透性化處理中不添 加任何表面活性劑，也不進行凍融處理。得到的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催 化劑立即用于所述的催化反應。根據本申請說明書描述的方法確定，該實施例的ClO, C12- LA產量達到10.05g/L。
[0122] 實施例6:本發明全細胞催化劑的制備
[0123] 該實施例的實施步驟如下：
[0124] 該實施例的實施方式與實施例1的實施方式相同，只是在步驟D透性化處理中添加 曲拉通X100。得到的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化劑立即用于所述的催化反 應。根據本申請說明書描述的方法確定，該實施例的ClO，C12-LA產量達到9.20g/L。
[0125] 實施例7:本發明全細胞催化劑的制備
[0126] 該實施例的實施步驟如下：
[0127] 該實施例的實施方式與實施例1的實施方式相同，只是在步驟D透性化處理中添加 CTAB。得到的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化劑立即用于所述的催化反應。根 據本申請說明書描述的方法確定，該實施例的ClO，C12-LA產量達到1.29g/L。
[012引實施例8:本發明全細胞催化劑的制備
[0129] 該實施例的實施步驟如下：
[0130] 該實施例的實施方式與實施例1的實施方式相同，只是在步驟D透性化處理中添加 SDS。得到的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化劑立即用于所述的催化反應。根據 本申請說明書描述的方法確定，該實施例的ClO，C12-LA產量達到3.63g/L。
[0131] 由實施例1-8的實施結果可W清楚地看出，通過吐溫80表面活性劑與凍融處理能 夠增加細胞壁和細胞膜的通透性，減少膜對底物和產物的傳質阻力，提高脂肪酸底物和產 物進出菌體的速率，從而顯著提高重組解脂亞羅酵母全細胞催化生成tlO，cl2-CLA的轉化 效率，非常明顯地提高tlO，cl2-CLA的產量。
【主權項】
1. 一種重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株全細胞催化劑的制備方法，其特征在于所 述制備方法的步驟如下： A、 確定菌體收集時間 在溫度-80 °C下保存的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株在YNBD平板培養基中在溫 度28 °C下活化培養4~5天，再在YNBD液體種子培養基中在溫度28 °C與轉速200rpm的條件下 搖床種子培養48h;得到的種子培養液接種于分別含有0.0~10.0 g/L油酸的YH)液體培養基 中進行培養，其中，添加的油酸代替YPD液體培養基中對應濃度的葡萄糖，使各組培養基中 的碳元素含量保持一致，同時在不同的培養時間取樣，樣品經洗滌、干燥，稱量并由下式計 算得到菌體干重： 菌體干重(g/L)=凍干菌體重量(g)/培養體系體積(L); 以培養時間為橫坐標，以菌體干重為縱坐標繪制生長曲線，由所述生長曲線確定收集 菌體時間為36h; B、 確定培養基中油酸濃度 將在含有0.0~10. 〇g/L油酸的YPD液體培養基中培養36h的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株培養液，在溫度4°C與8000r/min的條件下離心10min，并用滅菌生理鹽水洗滌2 次，收集酵母菌體，重懸于磷酸鹽緩沖液中，使其濕菌體終濃度為l〇〇g/L，再添加底物c9， cl2-LA，在轉速200rpm、溫度28°C與pH 6.8的條件下進行催化反應2處，根據丨10，(：12-1^產 量確定在培養基中的油酸濃度為5.0g/L; C、 確定培養細胞時間 重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株在含有5g/L油酸的YPD培養基中進行培養，收集 培養時間為32、36和40h的菌體，轉移至20ml磷酸鹽緩沖液中，再添加底物c9，C12-LA，在溫 度28°C下進行全細胞催化反應24h，將tlO，cl2-CLA產量最高的培養時間確定為培養細胞時 間;D、透性化處理 在根據步驟A-C確定的條件下，重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株在含有5g/L油酸 的YH)培養基中進行培養36h，收集培養時間為36h的菌體，重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9 菌株全細胞轉移至20ml磷酸鹽緩沖液中，將全細胞濕重調節至100g/L，再加入以體積計 0.5 %~3.0 %吐溫80，在搖床中在溫度28 °C與200rpm的條件下處理2h，于是得到能夠提高 tlO，C12-CLA產量的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化劑。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于重組解脂亞羅酵母菌株CCFM-JU277-9 保藏于在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC No.7284。3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟A中，所述的YH)液體培養基不含 油酸時，它是含有20g//L葡萄糖、10g/L酵母提取物與20gAJ夷蛋白胨的pH為6.8的培養基，該 培養基在溫度115°C下滅菌20min;所述的YH)液體培養基含有油酸時，只是使用油酸替代所 述YH)液體培養基中的葡萄糖，使它們含有的碳源和氮源比例基本保持一致，其它不變。4. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的YNBD液體種子培養基是含有 20g/L葡萄糖、1.7g/L無氨基酸無硫酸銨酵母氮源與5g/L硫酸銨的pH為5.5的培養基，該培 養基在溫度115°C下滅菌20min。5. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的YNBD固體種子培養基是含有 20g/L葡萄糖、1.7g/L無氨基酸無硫酸銨酵母氮源、5g/L硫酸銨與20g/L瓊脂粉的pH為5.5的 培養基，該培養基在溫度115°C下滅菌20min。6. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟B與D中，所述的磷酸鹽緩沖液是 濃度為50mM、pH 6.8的由磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀組成的緩沖液。7. 根據權利要求1所述的催化劑，其特征在于在步驟B中，所述的產量是以g/L計tlO， c 12-CLA產量與以g/L計菌體干重的比值。8. 根據權利要求7所述的催化劑，其特征在于所述的以g/L計tlO，cl2-CLA產量是重組 解脂亞羅酵母菌株CCFM-JU277-9全細胞催化反應生成的在細胞內和細胞外的以g計tlO， c 12-CLA總質量與以L計反應體系體積的比值。9. 根據權利要求1所述的催化劑，其特征在于在步驟D中，重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9菌株全細胞轉移至20ml磷酸鹽緩沖液中，將全細胞濕重調節至100g/L，接著采用液 氮速凍30s，然后在溫度28 °C的水浴中解凍4.5~5.5min，重復凍融1~5次，于是得到能夠提 高tlO，C12-CLA產量的重組解脂亞羅酵母CCFM-JU277-9全細胞催化劑。
【文檔編號】C12R1/645GK105925496SQ201610396579
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月7日
【發明人】張白曦, 陳衛, 宋宇航, 陳海琴, 趙建新, 顧震南, 田豐偉, 王剛, 楊芹, 陳永泉, 張灝
【申請人】江南大學