一種人β-防御素3基因果蠅誘導型表達載體的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種人β?防御素3基因果蠅誘導型表達載體的制備方法，通過設計合成兩對特異性引物H1，H2，H3和H4，得到了人β?防御素3基因片段，通過基因重組技術，將基因片段重組于pet28a載體上，構建pet28a?hBD?3重組載體，以pet28a?hBD?3重組質粒為模板，PCR擴增His?hBD?3片段，再將His?hBD?3片段插入到UASp?attB質粒中，制備果蠅表達載體UASp?attB?His?hBD?3。本發明提供了一種低成本、高效率制備人β?防御素3果蠅UASp誘導型轉基因載體的制備方法，為下一步利用果蠅大量表達人防御素3蛋白奠定基礎。
【專利說明】
-種人e-防御素3基因果蝸誘導型表達載體的制備方法
技術領域
[0001] 本發明設及一種人0-防御素 3基因果蛹誘導型表達載體的制備方法，具體設及一 種人e-防御素 3基因片段及其制備方法，W及將此人0-防御素 3基因片段插入到果蛹載體上 制備果蛹誘導型表達載體的方法。
【背景技術】
[0002] 防御素是生物體內具有強烈抗菌作用的一類多膚物質，具有分子量小、水溶性好 及熱穩定性強等特點。在抵抗外源有害微生物的反應中，具有抗菌譜廣、無免疫原性、不易 使微生物產生耐藥性等特點。此外，研究發現防御素還具有抗腫瘤作用。總之，防御素具有 獨特的研究價值及很強的應用價值。迄今為止共發現五類:Q-防御素、e-防御素、0-防御素、 植物防御素和昆蟲防御素。人類防御素包括a-防御素、0-防御素。0-防御素在人體皮膚和黏 膜上皮組織中廣泛表達。其分子結構穩定，能夠快速準確地識別并中和侵入機體的革蘭陽 性、陰性細菌，對真菌、包膜病毒和某些寄生蟲也會產生較強的殺傷作用，是宿主發揮天然 免疫的重要組成部分。此外，e-防御素還可W作為趨化因子連接先天性免疫和獲得性免疫 應答，在人體多種疾病中發揮重要作用。
[0003] 人郎方御素 3化uma址-defensin-3，hBD-3)是2001年發現的第S種人源性郎方御素， 在抗菌活性等方面具有明顯的優勢。與hBD-巧化抓-2的成熟膚蛋白序列比較，h抓-3含有13 個A巧和Lys,比它們分別多6個和7個帶正電荷的氨基酸，因此hBD-3(+ll)的電荷密度大約 是hBD-l(+4)和hBD-2(+6)的2倍，運對于hBD-3的抗菌活性可能有很大的提高W。相對于 h抓-1和hBD-2，hBD-3顯示出更廣的抗菌譜，對革蘭陰性菌和陽性菌均有抗菌活性，對多重 耐藥菌hBD-3也顯示出強有力的抗性。運些特點使其有望成為一種新型膚類抗菌素。
[0004] 防御素大規模臨床應用的最首要的問題是高生產成本。其一，防御素在生物體內 天然含量極少，天然資源有限;其二，化學合成法成本高，價格昂貴。而通過基因工程在工程 菌中直接表達防御素基因，易被細菌內部蛋白酶所降解，同時防御素可能對宿主具有毒性， 也限制了蛋白的高水平表達。如何提高防御素的產量，降低生產成本等問題成為目前防御 素生產實踐應用中的瓶頸。
[0005] 目前，國內外對人0-防御素 3的研究，多集中在運用基因工程技術對其進行克隆與 表達上，具體包括基因的獲取、重組表達載體的制備W及在細菌中高效表達。在原核生物 中，黃蓬亮等根據大腸桿菌對精氨酸密碼子使用偏好合成了人e-防御素 3,并在大腸桿菌中 誘導表達成功(生命科學研究，2005,9(2): 129-133)。李春麗等根據已知人0-防御素 3的成 熟區氨基酸序列和酵母密碼子的偏好，人工合成人e-防御素 3基因，成功制備表達載體 pPIC9K-h抓3(河南農業大學報，2005,39(3):282-285)。何國慶等嵌合人0-防御素 3與植物 甜蛋白基因，在大腸桿菌中誘導表達后，目的蛋白約占總蛋白的30% (農業生物技術學報， 2005,13(2))。然而，在原核表達體系中所表達的防御素常常無生物活性。
[0006] 在真核表達系統中，庚曉嘩等采用脂質體轉染法將pcDNA3-hBD3重組載體導入 C0S-7真核細胞，對hBD3進行表達(軍事醫學，2004,28(4): 344-346)。蔡紹輝等運用植物轉 基因技術，制備了人類人e-防御素 2的表達載體，并將此載體引入小麥的幼胚愈傷組織，為 隨后的h抓-2的高表達創造了一定的條件（四川大學學報偃學版），2003,34(3):386)。吳 辟、陳藝等將人hBD-3基因轉入釀酒酵母中進行表達，提取純化蛋白，并對其抗菌活性進行 研究(現代食品科技，2012(9) :1123-1127)。夏章權等人制備人郎方御素 3化BD3)基因真核表 達質粒載體，觀察其在大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)中的表達，并檢測了其活性(重慶醫 學，2012,41(1):51-53)。
[0007] 1993 年，Brand 和化 rrimon 構建了最初的轉基因 UAST 載體（development ,1993,118 (2) :401-415),后來發現，UAST轉基因載體在果蛹生殖系統的卵子發生過程中不發揮作用， 基因沒有表達。為了解決運個問題，1998年，Perni 11 e將UAST載體進行了改造，將UAS的數量 從5個提高到14個串聯，構建出UASp載體(參見Proceedings of the化tional Academy of Sciences of the United States of America,1996,93(22):12418-12422和Mechanisms of development, 1998,78(1): 113-118)，該載體在果蛹生殖系統中的表達量得到明顯提 高。其后，2007年Bischof等人繼續對UAST載體進行改造，將細菌-隧菌體的attP-attB系統 引入到果蛹體系，通過轉基因手段，首先在果蛹基因組上插入attP序列，然后在隨機插入型 的轉基因載體UAST上添加了attB序列，得到了 pUAST-attB定點插入型轉基因載體 (Proceedings of the 化tional Academy of Sciences,2007,104(9) :3312-3317),大大 地縮短了轉基因果蛹的制備時間。
【發明內容】
[0008] 基于W上情況，本發明提供了一種人e-防御素 3基因果蛹誘導型表達載體的制備 方法，通過基因工程的方法，制備了一種UASp高效誘導型表達人0-防御素 3載體，為下一步 利用果蛹大量表達人防御素 3蛋白奠定基礎。
[0009] 本發明采取的技術方案為：
[0010] 人0 -防御素 3基因片段，所述基因片段的核巧酸序列如右所示： ggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgTtgtgctgtgctcagctgccttccaaa 邑邑a邑邑aaca邑ate邑邑caa邑t邑etc邑ac邑C邑t邑邑CC邑Taaat邑Ct邑CC邑TCGTaa邑aaaTAAoltbSIS^tS；*^ GenBank中注冊的人(6-防御素 3基因（GenBank登錄號醒018661)序列相比，有少部分核巧酸 進行了改造，具體參見圖12,但其編碼的氨基酸序列沒有改變。經改進后的人0-防御素 3基 因，其表達水平將會提高。
[0011] 選取運一片段構建果蛹誘導型表達載體的原因在于:GenBank中注冊的人0-防御 素 3基因片段的長度為138個核巧酸，包括編碼45個氨基酸的膚段、1個終止密碼子TAA。此45 個氨基酸膚段即人郎方御素 3基因的成熟膚序列IINTLQKYYCRVRGGRC AVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRK r (參見文獻 Journal Of Biological Chemistry ,2001,276(8) :5707-13),此成熟膚具有很強的抗菌功能。
[001^ 本發明還提供了人0-防御素 3基因片段的制備方法，將四條特異性引物化、H2、H3 和H4經PCR擴增，且在Hl和H4中分別引入BamHl和化nd虹限制性酶切位點。所述四條特異性 引物序列如下：
[0013] Hl:5 ' -aaaGGATCCggaatca1:aaacacattacagaaatat1:attgcCGTgtcCGTgg-3 '，下劃線 表示帶有BamHl酶切位點；
[0014] H2:5 ' 一cttt邑邑aa邑邑Ca邑ct邑a邑caca邑cacaAc邑邑CC邑ccACG邑acACG邑caataa-3 '；
[0015] H3:5 ' 一ctca邑Ct邑ccttccaaa邑邑a邑邑aaca邑ate邑邑caa邑t邑etc邑ac邑C邑t邑邑CC-3 '；
[0016] H4:5 '-tttAAGCTTTTAtttcttACGAcggcagcatttAcggccacgcgtcgagcact-3 '，下劃線 表示帶有化ndm酶切位點。H1、H4引物中也可引入其它限制性內切酶位點，如Hl引物中的 BamHl可替換為EcoRl酶切位點;H4引物中的化nd虹可替換為化Ol酶切位點。
[0017] 由于人的基因組模板難W獲得，故將138bp的hBD-3基因分為四部分，設計出四條 引物（即化、肥、冊、^)，每條引物大約506口左右，利用引物搭橋的方法，將四種引物混合后 進行PCR擴增10個循環，獲得大量的人hBD-3基因。
[0018] 本發明還提供了一種人0-防御素 3基因果蛹誘導型表達載體的制備方法，所述制 備方法包括W下步驟：
[0019] (1)根據上述的人0-防御素 3基因片段的制備方法得到人0-防御素 3基因片段；
[0020] (2)將人0-防御素 3基因片段插入到pet28a載體中，制備pet28a-h抓-3重組載體；
[0021] (3)^步驟(2)得到的96*28曰-11抓-3重組質粒為模板少0?擴增化3-11抓-3片段；
[0022] (4)對UAST-attB載體進行改造，構建UASp-attB載體；
[0023] (5)將步驟(3)得到的His-hBD-3片段插入到步驟(4)得到的UASp-attB載體中，審U 備果蛹誘導型表達載體UASp-attB-His-h抓-3。
[0024] 所述步驟(2)具體包括W下步驟:用限制性內切酶BamHl和化nd虹雙酶切0-防御素 3基因片段和pet28a載體，將0-防御素 3基因片段插入到pet28a載體的BamHl和化nd虹之間。 此步驟中也可使用其它限制性內切酶進行雙酶切，如EcoRl與化Ol。為了把hBD-3帶上化S標 簽，除了可W把hBD-3基因插入到pet28a載體上，插入到其它原核表達載體上也可W實現， 如pRSETB質粒載體。
[0025] 進一步地，所述步驟(2)還包括pet28a載體酶切后加入CIAP，37 °C解育30分鐘，再 用T4連接酶將人h抓-3基因插入到pet28a載體的BamHl和化nd虹之間。
[00%]所述步驟（3)具體包括W下步驟：W步驟（2)得到的pet28a-h抓-3重組質粒為模 板，冊，冊為特異性引物，PCR擴增化s-h抓-3片段，所述冊，冊為特異性引物如下：
[0027]冊:5 ' -AAAggtaccATGGGCAGCAGCCATC-3 '，下劃線表示帶有 Kpnl 酶切位點；
[00 巧]冊：5 ' -TTTgcggccgcTTAtttcttACGAcggcagc-3 '，下劃線表示帶有 Notl 酶切位點。 在PCR擴增化s-hBD-3片段時，引入除Kpnl和Notl限制性酶切位點時，將冊引物中的Kpnl換 成Ascl，也能實現本發明。
[0029] 所述步驟(4)具體包括W下步驟：
[0030] 參照UASp序列（GenBank登錄號AY831681.1)合成引物H7和冊。WUASp轉基因果蛹 品系（美國bloomington果蛹中屯、庫，庫編號為23269)的基因組DNA為模板，WH7、冊為引物 PCR擴增UASp片段。將擴增的UASp片段和UAST-attB質粒用限制性內切酶Sbn和Xbal酶切， 用T4連接酶16°C過夜連接，轉化，即可得到UASp-attB質粒載體；
[0031] 所述H7、冊引物序列如下：
[0032] H7:5 ' -aaaCCTGCAGGATCTACTTTCCGCAAAAATGGG '，下劃線表示帶有訊 fl 酶切位點； [00；33]冊：5 ' -aaaTCTAGagcggccgctgg 化 ccggcgcgccAATGAACAGGACCTAACGCACAGTC-3，，下 劃線表示帶有Xbal、Notl、Kpnl、Ascl酶切位點。其中Xbal作為接頭，與Sbn共同引入UASp片 段。其余巧巾酶AscUKpnl和Notl作為UASp下游的多克隆酶切位點，用來插入外源片段；
[0034] 所述PCR擴增條件為:95°C預變性3min，然后運行熱循環:95°C變性15s，55°C退火 15s，72°C延伸253,35個循環后于72°(：繼續延伸5111^。
[0035] 所述步驟巧)具體包括W下步驟:首先用限制性內切酶Kpnl和Notl雙酶切步驟(3) 得到的化s-hBD-3片段、W及步驟(4)得到的UASp-attB質粒，然后將化s-h抓-3片段插入到 UASp-attB質粒的Kpnl和Notl之間。
[0036] 進一步地，所述步驟(5)還包括UASp-attB質粒酶切后加入CIAP，37°C解育30分鐘， 再用T4連接酶將化s-h抓-3片段插入到UASp-attB質粒的Kpnl和Notl之間。
[0037] 目前尚無人0-防御素 3在果蛹體內成功表達的報道，本發明利用基因工程技術，提 供了一種低成本、高效率制備人e-防御素 3基因果蛹UASp誘導型表達載體的制備方法。
【附圖說明】
[003引圖1為PCR擴增h抓-3基因。泳道M為化b DNA Marker(DNA長度的標準參照片段），泳 道1為在紫外光下可見138bp目的條帶，與理論符合；
[0039] 圖2為hBD-3基因片段與pet28a載體分別用BamHl和化nd虹雙酶切后的純化產物。 泳道M為沈b DNA Marker，泳道1為hBD-3基因酶切產物，泳道2為pet28a載體酶切產物；
[0040] 圖3為重組質粒pet28a-h抓-3的PCR鑒定。泳道M為2kb DNA Marker,泳道V'為陽 性對照，泳道1-15為在紫外光下可見138bp目的條帶，為陽性轉化子，泳道為陰性對照； [00川圖4為重組質粒96*28曰-1180-3的8曰111化、化11(1虹雙酶切鑒定。泳道1為15郵0論 Marker，泳道1 -3為陽性轉化子的酶切條帶；
[0042] 圖5為化s-hBD-3片段的擴增。泳道M為化b DNA Marker,泳道1為在紫外光下可見 約24化P左右的目的條帶，與理論符合；
[0043] 圖6為UASp片段的擴增。泳道M為2kb DNA Marker,泳道1為在紫外光下可見約 750bp左右的目的條帶，與理論符合；
[0044] 圖7為重組載體UASp-attB的PCR鑒定。泳道M為化b DNA Marker,泳道V'為陽性對 照，泳道2、4、6、8、9等分別為陽性轉化子，在紫外光下可見約750bp左右的目的條帶，泳道 為陰性對照；
[0045] 圖8為重組載體UASp-attB的訊n、Xbal雙酶切鑒定。泳道M為15化DNA Marker,泳 道1為陽性轉化子的酶切條帶；
[0046] 圖9為重組質粒UASp-attB-His-h抓-3的PCR鑒定。泳道M為化b DNA Marker，泳道 1-14為轉化子PCR產物，泳道為陰性對照，泳道V'為陽性對照，其中上下游鑒定引物朋 與冊分別位于UASp載體上及片段內部，目標片段大小為50化P左右；
[0047] 圖10為重組質粒UASp-attB-His-hBD-3的K叩UNotl雙酶切鑒定。泳道M為15化 DNA Marker,泳道1-3分別為1號、2號和3號陽性轉化子的酶切條帶；
[004引圖11為果蛹誘導型表達載體UASp-attB-His-h抓-3示意圖；
[0049] 圖12為人hBD-3基因成熟膚改造前后的序列。
【具體實施方式】
[0050] 本發明中所設及的載體、試劑、材料、引物的來源如下：
[0051 ] pet28a載體、pRSETB質粒、大腸桿菌D冊a感受態細胞:購自北京普如汀生物技術有 限公司；
[0052] 堿性憐酸水解酶CIAP、T4DNA連接酶、限制性內切酶BamHl、Hind虹、Sbf 1、時nl、 No 11、甜a 1和As C1購自TaKaRa公司；
[0053] pUAST-attB載體由東南大學生命科學研究院惠贈；
[0化4] 果蛹:基因型為7^*;口{1^5口-￥。口.1?曰64}09，購買自美國61〇〇1111叫1〇11果蛹中屯、庫， 該果蛹品系的庫編號為23269;
[0055] 9條引物化1-H9)均由上海生工生物工程有限公司合成與純化。
[0化6] 實施例1
[0057] -種人0-防御素3基因果蛹誘導型表達載體的制備方法，所述制備方法包括W下 步驟：
[0化引1.1人0-防御素 3基因化抓-3基因）的獲取及擴增
[0059] 本著不改變氨基酸序列的原則，對人hBD-3基因成熟膚138個核巧酸的編碼序列進 行了改造，W提高其表達水平。序列改造如下：
[0060] 人hBD-3基因成熟膚改造前序列：
[0061] <'gg過過tc過t過過過C過C過tt過C過g過過過t過tt過ttgc過g過gtc過g過ggcggccggtgtgctgtgctc過gctgccttcc過過 aggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggccgaaaatgctgccgaagaaagaaataa^
[0062] 人hBD-3基因成熟版改造后序列：
[0063] "ggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgTtgtgctgtgetcagetgccttccaa aggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggccg了aaatgctgccg了CG了aagaaata過，>
[0064] 依據改造后的目標序列，設計合成2對特異性的引物（即化，肥，冊，擬）四條搭橋引 物，且在化和H4中分別引入限制性酶切位點BamHl和化nd虹。
[00化]Hl:5 ' -aaaGGATCCggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTgg-3 '，帶有 BamHl酶切位點（下劃線表示）；
[0066] H2:5 ' 一ettt邑邑aa邑邑Ca邑Ct邑a邑caca邑cacaAc邑邑CC邑ccACG邑acACG邑caataa-3 '；
[0067] H3:5 ' -ctcagctgccttccaaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggcc-3 '；
[0068] H4:5 ' -tttAAGCTTTTAtttcttACGAcggcagcatttAcggccacgcgtcgagcact-3 '，帶有 化nd虹酶切位點（下劃線表示）。
[0069] 將四條引物加入PCR反應體系中，PCR擴增條件如下:95°C變性3min進入循環，95°C 變性15s，55°C退火15s，72°C延伸1〇3，10個循環后于72°(：繼續延伸5111111，得到目的基因片 段，將此PCR產物純化后作為模板，利用引物化和H4大量擴增，PCR擴增條件如下:95°C變性 3min進入循環，95°C變性153,55°(：退火153,72°(：延伸1〇3,30個循環后于72°(：繼續延伸 Smin，最后得到末端帶有BamHl和化nd虹酶切位點的138bp的hBD-3目的基因片段，如圖1所 /J、- O
[0070] 1.2 pet28a-h抓-3重組質粒的制備
[0071] 將上述的PCR產物純化后和pet28a載體分別用限制性內切酶BamHl和化nd虹雙酶 切，37°C-個小時，pet2&i載體再加入化1的CIAP，37°C解育30分鐘（如圖2)，再用T4連接酶 將人hBD-3基因插入到pet28a質粒中，16°C過夜連接。將連接產物導入到大腸桿菌D冊a感受 態細胞中，在含有氨節抗性的固體培養基中挑選陽性克隆，采用PCR擴增(如圖3)和雙酶切 (BamHl和化nd虹）鑒定重組質粒(如圖4)。從圖中可W看出：圖3顯示出一條138bp的片段，圖 4顯示pet28a-h抓-3質粒經BamHU化nd虹雙酶切后得到一條138bp小片段(條帶較弱）和一 條約化b的大片段。證明有138bp的外源片段插入到了質粒中，PCR與雙酶切的結果均表明， 已成功制備了 pet28a-h抓-3載體。將陽性克隆的菌液樣品送至生物公司測序，將測序結果 與設計的目標序列進行比對。結果表明，插入到pet28a載體中的人hBD-3基因 138bp長度的 編碼序列完全正確，具體序列如下：
[0072] "ggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgTtgtgctgtgctcagctgccttccaa 曰gg曰gg曰曰C曰g曰tcggc曰曰gtgctcg曰CgCgtggCCgT曰曰曰tgctgccgTCGT曰曰g曰曰曰TAA''。
[0073] 1.3 His-h抓-3片段的擴增
[0074] 設計一對特異性引物（即冊，H6 )，在冊和H6中分別引入Kpn 1和Not 1限制性酶切位 點，W上述制備的pet28a-h抓-3質粒為模板，PCR擴增His-h抓-3片段。PCR擴增條件如下：95 。(:變性3min進入循環，95°C變性15s，55°C退火15s，72°C延伸1〇3,30個循環后于72°(：繼續延 伸5min，得到目的基因片段。如圖5所示，PCR產物為一條240bp的條帶，與理論相符，證明得 到了化s-h抓-3基因片段。
[0075] 冊：5'-AAAgg化ccATGGGCAGCAGCCATC-3'，帶有Kpnl酶切位點（下劃線表示）；
[0076] H6 : 5 ' -TTTgcggccgcTTAtttcttACGAcggcagc-3 '，帶有Notl酶切位點（下劃線表 示)。
[0077] His-h抓3序列如下：
[007引 "ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTG GTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgT tgtgCtgtgCtC3gCtgCCttCC333gg3gg33C3g3tCggC33gtgCtCg3CgCgtggCCgT333tgCtgCCgTCG T過過g過過過D
[0079] 上述序列中上游10化P為帶有六個組氨酸標簽(6址is)的小膚（下劃線表示），編碼 34個氨基酸殘基。下游138bp為人hBD3基因的編碼序列，編碼45個氨基酸殘基。此融合序列 為后續的蛋白質純化提供了便利。
[0080] 1.4 UASp-attB載體的構建
[0081 ] 參照UASp序列（GenBank登錄號AY8 31681.1)設計兩條引物H7和冊，在H7和冊中分 別引入限制性酶切位點Sbn和Xbal等酶切位點。Wbloomington庫中編號為23269的果蛹 (y V*; P化ASp-YFP. Rab4} 09)的基因組DNA為模板、WH7和冊為引物，PCR擴增UASp片段。
[0082] PCR擴增條件如下:95°C變性3min進入循環，95°C變性15s，55°C退火15s，72°C延伸 25s，35個循環后于72°C繼續延伸5min，得到目的基因片段(如圖6)。其PCR結果如圖6所示， 圖6顯示出一條75化P左右的條帶，與理論相符，證明得到了 UASp片段。
[0083] 將擴增的片段和pUAST-attB質粒分別用訊n和Xbal雙酶切，用T4連接酶將目的片 段與pUAST-aUB質粒載體共解育，16 °C過夜連接，將連接產物轉化D冊a感受態細胞，挑選陽 性克隆搖菌12小時，進行菌液PCR鑒定。PCR鑒定結果如圖7所示，Sbfl和Xbal雙酶切鑒定結 果如圖8所示。圖7顯示擴增出一條約750bp的片段，圖8顯示UASp-attB質粒經訊n和Xbal雙 酶切后得到一條約750bp的小片段和一條約9肺的大片段，證明有約750bp的外源片段插入 到了質粒中。PCR和酶切結果均顯示，已成功制備了UASp-attB質粒載體。
[0084] H7 : 5 ' -aaaCCTGCAGGATCTACTTTCCGCAAAAATGGG'，帶有 Sbfl 酶切位點（下劃線表 示)；
[00化]冊：5 '-aaaTCTAGagcggccgctgg化ccggcgcgccAATGAACAGGACCTAACGCACAGTC-3'，帶 有甜曰1、齡1：1、邱]11和43(31酶切位點（下劃線表示）。
[0086] UASp序列如下(下劃線字母表示接頭序列）：
[0087] cctgcaggATCTACTTTCCGCAAAAATGGGTTTTATTAACTTACATACATACTAGAATTGGCCGCTCTAGCCCCCCC TCGAATGTTCTCTCTCTTCTCTTCTCTCTCTCTTTCTCGAATGTTCTCTCTCTTCTCTTCTCTCTCTCTTTCTCGAG GTCATCAAGCTTAGGCCTCCAAGGCGGAGTACTGTCCTCCGGGCTGGCGGAGTACTGTCCTCCGGCAAGGCGGAGTA CTGTCCTCCGGGCTGGCGGAGTACTGTCCTCCGGCAAGGCGGAGTACTGTCCTCCGGGCTGGCGGAGTACTGTCCTC CGGCAAGGCGGAGTACTGTCCTCCGGGCTGGCGGAGTACTGTCCTCCGGCAAGGCGGAGTACTGTCCTCCGGGCTGG CGGAGTACTGTCCTCCGGCAAGGCGGAGTACTGTCCTCCGGGCTGGCGGAGTACTGTCCTCCGGCAAGGCGGAGTAC TGTCCTCCGGGCTGGCGGAGTACTGTCCTCCGGCAAGGGTCGAGTCGATAGCCGAAGCTTACCGAAGTATACACTTA AATTCAGTGCACGTTTGCTTGTTGAGAGGAAAGGTTGTGTGCGGACGAATTTTTTTTTGAAAACCGGTGATAGAGCC TGAACCAGAAAAGATAAAAGAAGGCTATACCAGTGGGAGTACACAAACAGAGTAAGTTTGAATAGTAAAAAAAATCA TTTATGTAAACAATAACGTGACTGTGCGTTAGGTCCTGTTCATTggcgcgccgg1:accagcggccgctctaga。
[008引 1.5果蛹表達載體UASp-attB-His-h抓-3質粒的制備
[0089] 將上述擴增得到的化s-hBD-3片段和UASp-attB質粒分別用Kpnl和Notl進行雙酶 切，UASp-attB質粒酶切后再加入化1的CIAP，37 °C解育30分鐘;然后用T4連接酶將His-h抓- 3片段與UASp-attB質粒16°C過夜連接，將連接產物導入到大腸桿菌DH5a感受態細胞中，在 含有氨節抗性的固體培養基中挑選陽性克隆，PCR鑒定結果如圖9所示，Kpnl和Notl雙酶切 鑒定結果如圖10所示。圖9顯示采用上游引物朋(位于UASp載體上）及下游引物H6對轉化子 的克隆進行PCR擴增鑒定，得到一條大小為500bp左右的片段。圖10顯示UASp-attB-Ws- h抓-3質粒經KpnUNotl雙酶切后得到一條約24化P的小片段和一條約9肺的大片段，證明成 功制備了果蛹表達載體UASp-attB-Hi s-h抓-3。將陽性克隆的菌液樣品送至生物公司測序， 將測序結果與24化P的化s-h抓3目標序列比對。結果表明，His-h抓3融合序列24化P的編碼 序列完全正確，具體序列如下：
[0090] "ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTG GTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgT tgtgCtgtgCtC3gCtgCCttCC333gg3gg33C3g3tCggC33gtgCtCg3CgCgtggCCgT333tgCtgCCgTCG T過過g過過過D
[0091] H9:5 '-TCCTCCGGCAAGGGTCGAGTCGATA。
[0092] W上結果表明，經上述方法成功制備了果蛹表達載體UASp-attB-His-h抓-3。
[0093] 實施例2
[0094] -種人0-防御素 3基因果蛹誘導型表達載體的制備方法，所述制備方法包括W下 步驟：
[0095] 將實施例1步驟I. I中的H1、H4引物的酶切位點分別替換為EcoRl、化Ol限制性酶切 位點，并將1.2步驟中的雙內切酶替換為EcoRl和化Ol限制性內切酶，其它與實施例1相同。
[0096] 實施例3
[0097] -種人0-防御素 3基因果蛹誘導型表達載體的制備方法，所述制備方法包括W下 步驟：
[009引將實施例1步驟1.2中的pet28a質粒載體替換為pRSETB質粒載體，制備了pRSETB- h抓-3質粒載體，WpRSETB-h抓-3質粒載體為模板，冊和冊為引物，PCR擴增化s-h抓-3片段， 其它同實施例1。
[0099] 實施例4
[0100] -種人0-防御素 3基因果蛹誘導型表達載體的制備方法，所述制備方法包括W下 步驟：
[0101] 將實施例1步驟1.3中的冊引物中的Kpnl酶切位點替換為Ascl酶切位點，其它同實 施例1。
[0102] 上述參照實施例對人0-防御素 3基因果蛹誘導型表達載體的制備方法進行的詳細 描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離 本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種人β-防御素3基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸序列如下： ggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgTtgtgctgtgctcagctgccttc caaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggccgTaaatgctgccgTCGTaagaaaTAA〇2. 根據權利要求1所述的人β_防御素3基因片段的制備方法，其特征在于:設計四條特 異性引物Hl， Η2，Η3和Η4，且在Hl和Η4中分別引入BamHl和Hindm限制性酶切位點，進行PCR擴增，所 述四條特異性引物如下： Hl: 5 ' -aaaGGATCCggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTgg-3 '，下劃線表不 帶有BamHl酶切位點； H2:5 '-ctttggaaggcagctgagcacagcacaAcggccgccACGgacACGgcaataa-3 '； H3:5?-ctcagctgccttccaaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggcc-3 ?; H4:5 ' -tttAAGCTTTTAtttcttACGAcggcagcatttAcggccacgcgtcgagcact-3 '，下劃線表亦 帶有HindIE酶切位點。3. -種人β-防御素3基因果蠅誘導型表達載體的制備方法，其特征在于，所述制備方法 包括以下步驟： (1) 根據權利要求2所述的人β-防御素3基因片段的制備方法得到人β-防御素3基因片 段； (2) 將人β-防御素3基因片段插入到pet28a載體中，制備pet28a-hm)-3重組載體； (3) 以步驟(2)得到的pet28a-hm)-3重組質粒為模板，PCR擴增His-hm)-3片段； (4) 對UAST-attB載體進行改造，獲得UASp-attB載體； (5) 將步驟(3)得到的His-hBD-3片段插入到步驟(4)得到的UASp-attB質粒中，制備果 繩表達載體 UASp-attB-His-hBD-3。4. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)具體包括以下步驟:用限 制性內切酶BamHl和Hindm雙酶切β-防御素3基因片段和pet28a載體，將β-防御素3基因片 段插入到pet28a載體的BamHl和Hindm之間。5. 根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2)還包括pet28a載體酶切 后加入CIAP，37°C孵育30分鐘，再用T4連接酶將人hBD-3基因插入到pet28a載體的BamHl和 Hindm之間。6. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)具體包括以下步驟：以步 驟(2)得到的pet28a-hm)-3重組質粒為模板，以H5和H6為特異性引物，PCR擴增His-hBD-3片 段，所述H5與H6特異性引物的序列如下： H5:5 ' -AAAggtaccATGGGCAGCAGCCATC-3 '，下劃線表示帶有 Kpnl 酶切位點； H6:5 ' -TTTgcggccgcTTAtttcttACGAcggcagc-3 '，下劃線表示帶有 Not 1 酶切位點。7. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)具體包括以下步驟： 以果蠅的基因組DNA為模板，H7、H8為引物PCR擴增UASp片段； 將擴增的UASp片段和pUAST-attB質粒用限制性內切酶Sbfl和Xbal酶切，用T4連接酶16 °C過夜連接，轉化，即可得到UASp-attB質粒載體； 所述H7、H8引物序列如下： H7:5 ' -aaaCCTGCAGGATCTACTTTCCGCAAAAATGGG '，下劃線表示帶有Sbfl 酶切位點； Η8:5 ' -aaaTCTAGagcggccgctggtaccggcgcgccAATGAACAGGACCTAACGCACAGTC-3 '，下劃線 表示帶有Xbal、Notl、Kpnl和Ascl酶切位點。8. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)具體包括以下步驟:用限 制性內切酶Kpnl和Notl雙酶切步驟(3)得到的His-hBD-3片段和步驟(4)得到的UASp-attB 質粒，將His-hBD-3片段插入到UASp-attB質粒的Kpnl和Notl之間D9. 根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)還包括UASp-attB質粒酶 切后加入CIAP，37°C孵育30分鐘，再用T4連接酶將His-hBD-3片段插入到UASp-attB質粒的 Kpnl和Notl之間D
【文檔編號】C12N15/12GK105925585SQ201610559462
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月15日
【發明人】陳冬生, 王雙
【申請人】安徽師范大學