一種乙酰膽堿酯酶的復合固定化方法
【專利摘要】本發明屬于酶固定化技術領域，特別涉及一種乙酰膽堿酯酶的復合固定化方法。所述方法包括以下步驟：(1)載體活化：對固定化載體表面進行修飾活化，使其具有與間隔臂分子連接的能力；(2)乙酰膽堿酯酶固定化載體的制備：將所述固定化載體與間隔臂分子、關鍵配基分子依次連接，制備成乙酰膽堿酯酶固定化載體；(3)固定化酶的制備：將所述乙酰膽堿酯酶固定化載體與乙酰膽堿酯酶分子孵育，得到復合固定化乙酰膽堿酯酶。
【專利說明】
-種乙醜膽堿醋酶的復合固定化方法
技術領域
[0001] 本發明屬于酶固定化技術領域，特別設及一種乙酷膽堿醋酶的復合固定化方法。
【背景技術】
[0002] 酶是一種主要W蛋白為結構基礎的生物催化劑，與化學催化劑相比，具有反應條 件溫和、催化效率高、專一性強、污染低等優點，在工業、農業、醫藥和食品等各個領域應用 廣泛。
[0003] 乙酷膽堿醋酶（簡稱AChE)是膽堿醋酶的一大類，廣泛存在于人、動物、昆蟲等體 內，可專一性地將乙酷膽堿水解為膽堿和乙酸。乙酷膽堿醋酶可被有機憐、氨基甲酸醋類農 藥特異性抑制，因此乙酷膽堿醋酶被廣泛用于農藥檢測、環境檢測等多個領域。
[0004] 酶的固定化技術化nzyme Immobilization)是指將酶束縛或限制于一定區域內， 但仍保留其催化特性并可回收和重復使用的一類技術。固定化酶與游離酶相比，主要有下 列優點：（1)產物不易被酶污染，簡化后續的分離提純工藝；（2)在大多數情況下，酶在固定 化后穩定性會得到提高并可重復使用，從而便于連續化生產，降低生產成本；（3)固定化酶 具有一定的機械強度，可W采用攬拌或裝柱的方式使用，便于生產過程實現管道化、連續化 和自動化。由于運些特性，固定化酶在工業、農業、醫藥和食品等各個領域被廣泛采用。
[0005] 目前，乙酷膽堿醋酶固定化多采用吸附法和交聯法。吸附法是利用分子的范德華 力、氨鍵作用或靜電作用將酶分子吸附在特定多孔性材料的表面或空隙中。此方法雖然可 有效固定酶，但其底物受到多孔材料的傳質性的阻礙，導致吸附酶的實際反應速率和活性 明顯下降，同時由于吸附作用受環境影響較大，一旦外部環境變化，固定酶的穩定性會受到 巨大影響。交聯法通過(雙或多間能試劑進行酶蛋白之間的交聯，酶分子和多功能試劑之 間形成共價鍵，凝集呈網狀，生成不溶于水的二維交聯聚集體。交聯法雖然可W大幅提高固 定酶的穩定性，但在交聯過程中形成的共價鍵為隨機產生，難W控制，除了酶分子之間發生 交聯外，還存在著一定的酶分子內交聯，此種酶分子內交聯嚴重影響酶的原有結構和構象， 使固定酶活性急劇下降。
[0006] 由于上述酶固定化方法存在顯著缺陷，目前，已有的乙酷膽堿醋酶固定化方法不 能滿足實際應用的性能要求，即同時保證固定化乙酷膽堿醋酶的高效性、高活性和高穩定 性。此問題已成為固定化乙酷膽堿醋酶實際應用的瓶頸。因此，急需一種專口針對乙酷膽堿 醋酶的結構和功能特點設計的酶固定化方法，改善現有固定化乙酷膽堿醋酶的性能。
【發明內容】
[0007] 本發明提供了一種乙酷膽堿醋酶的復合固定化方法，具體技術方案如下：
[000引一種乙酷膽堿醋酶的復合固定化方法，包括W下步驟：
[0009] (1)載體活化:對固定化載體表面進行修飾活化，使其具有與間隔臂分子連接的能 力；
[0010] (2)乙酷膽堿醋酶固定化載體的制備:將所述固定化載體與間隔臂分子、關鍵配基 分子依次連接，制備成乙酷膽堿醋酶固定化載體；
[0011] (3)固定化酶的制備:將所述乙酷膽堿醋酶固定化載體與乙酷膽堿醋酶分子解育， 得到復合固定化乙酷膽堿醋酶。
[0012] 所述乙酷膽堿醋酶的來源包括人、動物、植物、微生物。
[0013] 步驟（1)中所述固定化載體包括聚合物、電極、介孔材料、納米材料、無機材料、復 合材料等一切可固載酶的介質。優選地，步驟（1)中所述固定化載體包括分子篩介孔材料、 玻碳電極表面、金電極表面、玻璃纖維膜、石英纖維膜、濾紙。
[0014] 在本發明中，間隔臂是指用于連接固定化載體與關鍵配基分子的分子，其用途在 于增加固定化載體與關鍵配基分子的距離，增強關鍵配基分子的靈活度；間隔臂包括但不 限于鏈狀分子、聚合物分子、樹枝狀分子。優選地，所述間隔臂包括單鏈分子、單鏈狀聚合 物、多官能團聚合物、樹枝狀分子納米材料。
[0015] 所述關鍵配基分子的結構包括結構I、結構Π 、結構虹、結構IV四種類型及各自的 手性異構體、各自的互變異構體；
[0011
[0017] 其中，虹、1?2、1?3、1?4、1?5、1?6和化各自可^相同或不同，均可為氨、面素、徑基、簇基、氨 基、硝基、氯基、琉基、橫酸基、甲氧基、乙氧基、苯基、苯酪基、Ci-Cs烷基、Ci-Cs面代烷基、Ci- C4烷基氨基、C5-C6糖基中的任意一種基團。
[0018] 步驟(1)中，對固定化載體表面進行修飾活化的方法包括化學方法、物理方法或復 合方法。
[0019] 固定化載體與間隔臂的連接方式包括所有直接、間接和復合型的化學連接和物理 連接。
[0020] 關鍵配基分子與間隔臂的連接方式包括所有直接、間接和復合型的化學連接和物 理連接。
[0021] 本發明具有W下有益效果：
[0022] 1、固定化乙酷膽堿醋酶能保留游離酶高的活性和專一性;本發明方法得到的固定 化乙酷膽堿醋酶的回收率>75% ;
[0023] 2、固定化乙酷膽堿醋酶的穩定性得到了極大提高，使用范圍更為廣泛;在保存10 天后，本發明方法得到的固定化乙酷膽堿醋酶酶活仍可保持90 % W上；
[0024] 3、固定化乙酷膽堿醋酶可重復使用多次，酶活保持良好;本發明方法得到的固定 化乙酷膽堿醋酶重復使用10次W上，酶活仍能保持在70% W上；
[0025] 4、本發明方法對乙酷膽堿醋酶的固載量大，可廣泛應用于工業生產。
[0026] 本發明乙酷膽堿醋酶的復合固定化方法可有效提高固定化乙酷膽堿醋酶的活性、 穩定性和固定效能。
【具體實施方式】
[0027] 本發明通過下述實施例進行詳細說明，但本領域人員應了解，下述實施例不是對 本發明保護范圍的限制，任何在本發明基礎上做出的改進和變化，都在本發明的保護范圍 之內。
[00%]復合固定化乙酷膽堿醋酶的活性檢測方法
[0029] 反應體系終體積0.2 m 1，10 0 μ L 0 . 1 m 01 / L，P Η = 8.0的憐酸緩沖溶液，5 0 μ L 0.75mmol/L底物(艦化硫代乙酷膽堿），50化酶源（調整蛋白含量在40~80yg/mL)或等酶量 的固定化酶，在37°C下反應5min，加入1.8ml DTNB-憐酸鹽-乙醇試劑，在41化m波長下進行 比色測定，調透光度到100%的空白管加入顯色劑后再加入與測定管等量的酶液，W消除酶 本身對光吸收的影響。
[0030] 實施例1--結構I類型
[0031] 固定化載體選用直徑3mm的玻碳電極，首先使用氧化侶粉末對玻碳電極表面進行 打磨，之后用蒸饋水洗凈并用O.lmol/L稀硝酸進行載體活化，采用3-氨基丙基Ξ乙氧基的 甲苯溶液回流的方法對上述玻碳電極表面進行修飾。關鍵配基分子結構為結構I類型分子， 其中Ri、R4和R3為徑基，R2、Rs和R?為氨，R6為氨基。選用戊二醒作為間隔臂，在25°C的條件下 將玻碳電極插入5%戊二醒的乙酸溶液中，輔助攬拌反應2小時，反應后使用乙酸清洗玻碳 電極表面3次。之后，在25°C的條件下將玻碳電極置于含有1%關鍵配基分子的乙酸溶液中， 輔助攬拌反應2小時，反應后使用乙酸清洗玻碳電極表面3次。通過上述步驟，將修飾后的玻 碳電極、間隔臂、關鍵配基分子依次相連，組成乙酷膽堿醋固定化載體。在4°C的條件下，將 乙酷膽堿醋酶固定化載體與乙酷膽堿醋酶的憐酸緩沖溶液(抑=7.4,0.05mol/L)解育24小 時，獲得復合固定化乙酷膽堿醋酶。
[0032] 根據"復合固定化乙酷膽堿醋酶的活性檢測方法"部分的操作流程，對復合固定化 乙酷膽堿醋酶的活性進行測試，結果如下：
[0033] 本實施例獲得的復合固定化乙酷膽堿醋酶的酶活性回收率為83.2%。重復10次使 用，酶活性較首次使用的固定化酶活性可W保持79.3%W上。在-22°C0.05M憐酸緩沖溶液 保存10天，酶活性較第一天使用的固定化酶活性可W保持96.1%?上。
[0034] 實施例2--結構虹類型
[0035] 固定化載體選用直徑3mm金電極，首先使用氧化侶粉末對金電極表面進行打磨，之 后用蒸饋水洗凈并用O.lmol/L稀硝酸進行載體活化，待用。關鍵配基分子結構為結構虹類 型分子，其中化、R2和R4為徑基，R3和R6為氨，Rs為甲基，化為氨基。選用PAMAM(G4)樹枝狀分子 作為間隔臂，在35°C的條件下將金電極電極插入5%PAMAM(G4)樹枝狀分子的乙醇溶液中， 輔助攬拌反應3小時，反應后使用乙醇清洗玻碳電極表面3次。之后，在30°C的條件下將金電 極置于含有1%關鍵配基分子的乙醇溶液中，輔助攬拌反應24小時，反應后使用乙醇清洗玻 碳電極表面3次。通過上述步驟，將活化后的金電極、間隔臂、關鍵配基分子依次相連，組成 乙酷膽堿醋固定化載體。在4°C的條件下，將乙酷膽堿醋酶固定化載體與乙酷膽堿醋酶的憐 酸緩沖溶液(pH=7.4,0.05mol/L)解育24小時，獲得復合固定化乙酷膽堿醋酶。
[0036] 根據"復合固定化乙酷膽堿醋酶的活性檢測方法"部分的操作流程，對復合固定化 乙酷膽堿醋酶的活性進行測試，結果如下：
[0037] 本實施例獲得的復合固定化乙酷膽堿醋酶的酶活性回收率為78.5%。重復10次使 用，酶活性較首次使用的固定化酶活性可W保持75.8%W上。在-22°C0.05M憐酸緩沖溶液 保存10天，酶活性較第一天使用的固定化酶活性可W保持93.5% W上。
[0038] 實施例3--結構IV類型
[0039] 固定化載體選用硅膠顆粒，首先向20g硅膠顆粒中加入2mL 3-漠丙基Ξ甲氧基娃 燒和lOOmL甲苯溶液，回流48小時，甲苯洗凈并減壓旋蒸移出溶劑，制成活化的修飾硅膠，待 用。關鍵配基分子結構為結構m類型分子，其中Ri、R3和R4為徑基，R2、Rs和R6為氨，化為漠。選 用聚乙二醇（分子量:200化)作為間隔臂，在25°C的條件下將修飾硅膠置于1%的聚乙二醇 (分子量:200化）乙酸溶液中，并加入0.5 %化0H作為催化劑，輔助攬拌反應12小時，反應后 使用乙酸清洗硅膠3次。之后，在25°C的條件下將硅膠置于1%的關鍵配基分子的乙酸溶液 中，并加入0.5%化0H作為催化劑，輔助攬拌反應24小時，反應后使用乙酸清洗玻碳電極表 面3次。通過上述步驟，將修飾硅膠、間隔臂、關鍵配基分子依次相連組成乙酷膽堿醋固定化 載體。在4°C的條件下，將乙酷膽堿醋酶固定化載體與乙酷膽堿醋酶的憐酸緩沖溶液(pH = 7.4,0.05mol/L)解育24小時，獲得復合固定化乙酷膽堿醋酶。
[0040] 根據"復合固定化乙酷膽堿醋酶的活性檢測方法"部分的操作流程，對復合固定化 乙酷膽堿醋酶的活性進行測試，結果如下：
[0041] 本實施例獲得的復合固定化乙酷膽堿醋酶的酶活性回收率為75.9%。重復10次使 用，酶活性較首次使用的固定化酶活性可W保持72.3%W上。在-22°C0.05M憐酸緩沖溶液 保存10天，酶活性較第一天使用的固定化酶活性可W保持92.6% W上。
【主權項】
1. 一種乙酰膽堿酯酶的復合固定化方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 載體活化:對固定化載體表面進行修飾活化，使其具有與間隔臂分子連接的能力； (2) 乙酰膽堿酯酶固定化載體的制備:將所述固定化載體與間隔臂分子、關鍵配基分子 依次連接，制備成乙酰膽堿酯酶固定化載體； (3) 固定化酶的制備:將所述乙酰膽堿酯酶固定化載體與乙酰膽堿酯酶分子孵育，得到 復合固定化乙酰膽堿酯酶。2. 根據權利要求1所述的復合固定化方法，其特征在于，所述乙酰膽堿酯酶的來源包括 人、動物、植物、微生物。3. 根據權利要求1所述的復合固定化方法，其特征在于，步驟（1)中所述固定化載體包 括聚合物、電極、介孔材料、納米材料、無機材料、復合材料。4. 根據權利要求3所述的復合固定化方法，其特征在于，步驟（1)中所述固定化載體包 括分子篩介孔材料、玻碳電極表面、金電極表面、玻璃纖維膜、石英纖維膜、濾紙。5. 根據權利要求1所述的復合固定化方法，其特征在于，所述間隔臂包括鏈狀分子、聚 合物分子、樹枝狀分子。6. 根據權利要求5所述的復合固定化方法，其特征在于，所述間隔臂包括單鏈分子、單 鏈狀聚合物、多官能團聚合物、樹枝狀分子納米材料。7. 根據權利要求1所述的復合固定化方法，其特征在于，所述關鍵配基分子的結構包括 結構I、結構π、結構m、結構IV四種類型及各自的手性異構體、各自的互變異構體；其中，1^、1?2、1?3、1?4、1^、1?6和辦為氫、鹵素、羥基、羧基、氨基、硝基、氰基、巰基、磺酸基、甲 氧基、乙氧基、苯基、苯酚基、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C 1-C4烷基氨基、C5-C6糖基中的任意 一種基團。8. 根據權利要求1所述的復合固定化方法，其特征在于，步驟（1)中，對固定化載體表面 進行修飾活化的方法包括化學方法、物理方法或復合方法。9. 根據權利要求1所述的復合固定化方法，其特征在于，固定化載體與間隔臂的連接方 式包括所有直接、間接和復合型的化學連接和物理連接。10. 根據權利要求1所述的復合固定化方法，其特征在于，關鍵配基分子與間隔臂的連 接方式包括所有直接、間接和復合型的化學連接和物理連接。
【文檔編號】C12N11/06GK106011126SQ201610460093
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】孫英, 刁劍雄, 于曉璐
【申請人】中國農業大學