一種Fe^3＋依賴型食品級酸性脲酶及其在黃酒中的應用

一種Fe^3＋依賴型食品級酸性脲酶及其在黃酒中的應用
【專利摘要】本發明公開了一種Fe3+依賴型食品級酸性脲酶及其在黃酒中的應用，屬于生物工程技術領域。本發明采用來自于食品級宿主地衣芽孢桿菌且依賴于Fe3+的酶，Fe3+依賴性脲酶相對于Ni依賴性脲酶所存在的安全隱患來說，是真正意義上的食品級脲酶。本發明所獲得的Fe3+依賴型食品級酸性脲酶能夠高效的降解黃酒中的尿素和氨基甲酸乙酯(添加酶量為500U/L時，可消除黃酒中90％的尿素及30％左右的EC)，從而實現從源頭到終端對氨基甲酸乙酯的控制，為實現脲酶工業化生產奠定了基礎，具有巨大的經濟及社會效益。
【專利說明】
-種Fe3+依賴型食品級酸性服酶及其在黃酒中的應用
技術領域
[0001] 本發明設及一種Fe3+依賴型食品級酸性脈酶及其在黃酒中的應用，屬于生物工程
技術領域。
【背景技術】
[0002] 脈酶(化ease，EC3.5.1.5 )，廣泛存在于動物、植物、細菌、真菌等中，其能專一性的 催化尿素水解產生兩分子氨和一分子碳酸。脈酶是世界上首次成功獲得的結晶態的酶，它 于1926年由Summer首次從刀豆中提取出。根據脈酶作用的最適pH值，可將脈酶分為酸性脈 酶、中性脈酶和堿性脈酶。
[0003] 氨基甲酸乙醋化thyl化rbamate或化ethane，簡稱EC)，具有遺傳毒性及致癌性， 廣泛存在于多種發酵食品（如醬油、食醋、泡菜)和酒精飲料(如黃酒、白酒、葡萄酒等）中。研 究證實發酵食品（如黃酒、醬油等）中尿素是EC形成的主要前體物質，它和乙醇自發的反應 生成EC，從而嚴重影響人類的健康。酸性脈酶可W高效消除發酵食品（如酒精類飲料）中的 尿素，從而可W有效的減少了 EC的形成。
[0004] 但是，已報道的脈酶均為Ni2+依賴性脈酶，Ni2+作為重金屬，對人類的健康影響也 存在隱患。因此，嚴格來講，Ni2+依賴性脈酶均為非食品酶，應用于食品中時存在安全隱患。 而鐵是人體含量的必需微量元素，是血紅蛋白的重要部分，人全身都需要它，運種礦物質可 W存在于向肌肉供給氧氣的紅細胞中，還是許多酶和免疫系統化合物的成分。鐵對人體的 功能表現在許多方面，鐵參與氧的運輸和儲存;促進發育;增加對疾病的抵抗力；調節組織 呼吸，防止疲勞;構成血紅素，預防和治療因缺鐵而引起的貧血;使皮膚恢復良好的血色。鑒 于鐵對人體有益的功能，可W添加到食品中，因此可W認定Fe3+依賴性脈酶為真正的食品 酶。
[0005] 因此，有必要尋找能夠真正用于食品的食品級化依賴性脈酶。

【發明內容】

[0006] 為了解決上述問題，本發明獲得了化依賴型酸性脈酶，且該酶來源于食品級的宿 主(地衣芽抱桿菌），是真正的食品酶，因此可W應用于發酵食品中尿素和EC的消除，且不存 在安全隱患。本發明是繼于2011年在關鼠螺桿菌中發現鐵依賴型脈酶后第二個所發 現的鐵依賴型脈酶，而前者發現在的鐵依賴性脈酶受氧的影響，酶氧化后無活性，而本發明 所發現的Fe3+依賴性脈酶不受氧的影響，從而更加的穩定，更有利于在發酵食品中應用，且 能夠降解EC，因此更具有應用價值。本發明的Fe3+依賴型食品級酸性脈酶能夠高效的降解黃 酒中的尿素及EC(添加酶量為500U/L時，可消除黃酒中90%及W的尿素及27%左右的EC)。
[0007] 本發明的第一個目的是提供一種食品級酸性脈酶在發酵食品中的應用，其特征在 于，所述應用是采用Fe3+依賴型食品級酸性脈酶。
[000引所述Fe3+依賴型食品級酸性脈酶原始來源于食品級宿主地衣芽飽桿菌，于重組大 腸桿菌化.coli化21DE3/PRS抑uet-ure化）中表達，重組菌構建過程已于之前所申請的專 利 CN201510218597.1 中陳述。
[0009] 所述酸性脈酶含有W下特征之一：
[0010] (1)結構亞基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.2、沈Q ID N0.3、 沈Q ID NO.4所示；
[0011] (2)結構亞基的氨基酸序列是在（1)中氨基酸序列的基礎上經過取代、缺失或者添 加一個或幾個氨基酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙醋水解酶及脈酶活性的由（1)衍生的 蛋白質；
[0012] (3)具有SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列。
[0013] 在本發明的一種實施方式中，所述應用，是用于降低或消除發酵食品中的尿素和/ 或氨基甲酸乙醋。
[0014] 在本發明的一種實施方式中，所述發酵食品包括酒精類飲料、醬油。
[0015] 在本發明的一種實施方式中，所述發酵食品為黃酒、白酒、葡萄酒等。
[0016] 在本發明的一種實施方式中，所述Fe3+依賴型食品級酸性脈酶來源于Bacillus licheniformis 9945A。
[0017] 在本發明的一種實施方式中，所述Fe3+依賴性食品級酸性脈酶是W大腸桿菌、枯草 芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌或者乳酸菌為生產菌株發酵生產得到的。
[0018] 在本發明的一種實施方式中，所述生產菌株在發酵生產過程中添加化3+。
[0019] 本發明還提供一種發酵生產酸性脈酶的方法，其特征在于，所述方法，是在生產菌 株發酵生產的過程中添加 Fe3+;所述酸性脈酶為含有W下特征之一 ：（1)結構亞基化eA、 化68、化6(：的氨基酸序列分別如沈9 10^.2、569 10顯.3、沈9 10^.4所示；（2)結構亞 基的氨基酸序列是在（1)中氨基酸序列的基礎上經過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基 酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙醋水解酶及脈酶活性的由（1)衍生的蛋白質；（3)具有SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列。
[0020] 在本發明的一種實施方式中，所述生產菌株為食品級生產菌株。
[0021] 在本發明的一種實施方式中，所述生產菌株為枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌或者 乳酸菌。
[0022] 本發明的有益效果：
[0023] 本發明通過重組菌誘導表達時向培養基中分別添加 NiS〇4及FeCl3,測定所表達的 酶活力，確認所獲得的酸性脈酶為Fe3+依賴型脈酶，是一個真正意義上的食品酶。本發明的 Fe3+依賴型脈酶應用于發酵食品中尿素和EC的消除時，無因 Ni依賴性脈酶而帶來的安全隱 患。本發明的Fe3+依賴性脈酶可W高效的消除黃酒中的尿素和EC(添加酶量為500U/L時，可 消除黃酒中90%的尿素及27%左右的EC)，從而實現從源頭到終端對氨基甲酸乙醋的控制， 具有巨大的應用價值。
【附圖說明】
[0024] 圖1:培養基中添加金屬離子(NiCb及化Cl3)時，脈酶及EC酶活力；
[0025] 圖2:地衣芽抱桿菌Fe3+依賴性雙功能酸性脈酶純化過程SDS-PAGE電泳圖；其中M: 標準分子量蛋白，1:粗酶液，2:硫酸氨沉淀，3: DEAE離子交換層析，4: Phenyl疏水作用層析， 5: MonoQ離子交換層析，6:凝膠過濾層析。
【具體實施方式】 [00%] 材料與方法：
[0027]地衣芽抱桿菌發酵培養基：lg/L yeast extract，2g/L(NH4)2S〇4,5g/L EC，0.1% 的礦物鹽混合物，0.24%肥陽S，pH 6.0
[002引氯化錠標準曲線的繪制：用超線水配制0 . Immol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、 0.4mmol/L、0.5mmol/L的NH4+標準溶液。用移液管準確移取ImL NH4+標準梯度液分別置于 序編號的lOmL比色管中。37 °C下恒溫保溫30min，立即用吸ImL終止劑于比色管中，振蕩混 勻。再依次加入ImL顯色劑I和顯色劑II，強烈振蕩，使之充分混勻，反應20min。超純水定容 至lOmL，在625nm下比色測定0D值，W0D值為縱坐標，饑產梯度為橫坐標作圖，得到標準曲線。
[0029] 脈酶及氨基甲酸乙醋水解酶酶活測定方法:取兩支lOmL比色管，分別加入ImL酶液 和ImL滅活的酶液。然后在兩管中分別加入ImL 3%尿素（用20mM pH 4.5的巧樣酸緩沖液配 制），在37°C恒溫水浴箱中反應30min后，在兩管各加入ImL終止劑（10%Ξ氯乙酸），混勻后 加入ImL的顯色劑I (15g苯酪和0.625g亞硝基鐵氯化鋼用超純水定容至250mL)和ImL顯色劑 II(13.125g化0H和7.5mLNaC10用超純水定容至250mL)，強烈震蕩，繼續在37°C恒溫水浴箱 中保溫20min后取出，用超純水稀釋到10血，625nm處比色，測定0D值，計算酶活(采用氯化錠 繪制標準曲線）。
[0030] 脈酶及氨基甲酸乙醋水解酶酶活單位定義:在常壓，20mM pH4.5巧樣酸-巧樣酸鋼 緩沖液及37°C條件下，每分鐘降解尿素生成2μπιο1 NH4+所需要的酶量為一個酶活力單位。 [0031 ]氨基甲酸乙醋水解酶酶活單位定義:在常壓，20mM ρΗ4.5巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液 及37°C條件下，每分鐘降解尿素生成?μL?ο? ΝΗ4+所需要的酶量為一個酶活力單位。
[0032] 實施例1:化依賴型食品級酸性脈酶的鑒定
[0033] 挑取-80°C保藏的重組大腸桿菌化21(DE3)/pRS抑uet-ure化菌株在LB固體培養基 (含有5化g/血卡那霉素）上劃線，于37°C培養12h后，取單菌落接種于接種于25mL、含有50μ g/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37°C震蕩培養過夜。第二天按1%接種量轉接至含有50μ g/mL卡那霉素的ΤΒ培養基中，培養至菌濃OD6〇o = 0.6時，加入IPTG至終濃度為1mmol/L誘導， 同時分別添加終濃度為2mM的NiCl2及FeCl3，W不添加金屬離子來作為對照。30°C培養lOh， 離屯、收集菌體，用20mM pH4.5巧樣酸-巧樣酸緩沖液重懸細胞，通過超聲破壁、離屯、取上清， 測定脈酶及氨基甲酸乙醋水解酶活力。由圖1可得，無 Μ或Fe添加時，基本上表達的酶無活 力，當培養基中添加 NiS〇4及FeCl3時酶活力得到極大的提高，且加 Fe時脈酶活力是加 Μ時脈 酶活力的1.7倍，因此該酶認定為化依賴性脈酶。
[0034] 實施例2:地衣芽抱桿菌化依賴型食品級酸性脈酶的純化
[0035] (1)地衣芽抱桿菌粗酶液的制備
[0036] 挑取-80°C保藏的菌株Bacillus licheniformis 9945Α在營養肉湯固體培養基上 劃線，于3(TC培養20h后，取單菌落接種于新鮮的地衣芽抱桿菌發酵培養基中在3(TC轉速為 20化· min-i的搖床上繼續培養20h。將菌液4°C1000化pm離屯、5min，棄上清，沖洗菌體并重懸 于50mM pH4.5的巧樣酸緩沖液中，菌體終濃度為0.1 g/ml。將菌體置于冰水浴中進行超聲破 碎，超聲破碎的條件為：功率70W，工作2s間隔4s，重復工作30min，至菌體溶液變清澈為止。 將破碎液于4°C1200化pm離屯、lOmin，轉移上清液于干凈的離屯、管中低溫保存。
[0037] 此外，發明人發現，如果再發酵培養基中添加2mM FeCb能夠顯著提高粗酶液中脈 酶的酶活。
[0038] (2)硫酸錠分級沉淀
[0039] 將固體硫酸錠研磨至細粉狀，在7(TC烘箱中烘干至恒重。將固體硫酸錠緩慢加入 到粗酶液中，并不斷攬拌至飽和度為40%，4°C靜置4h，10000rpm離屯、20min棄沉淀取上清， 并向上清中繼續加入固體硫酸錠至飽和度為80%，如上述條件進行沉淀離屯、棄上清取沉 淀。然后將蛋白沉淀溶解于適量20mmol -[袖7.0的憐酸鹽緩沖溶液中，用透析袋在相同 的緩沖溶液中對蛋白樣品透析脫鹽。
[0040] (3)離子交換層析
[0041 ]起始緩沖液A:20mmol · L-ipH 7.0的憐酸鹽緩沖溶液。洗脫緩沖液B:含Imol · L- iNaCl的20mmol .L-1抑7.0的憐酸鹽緩沖溶液。采用化Trap DEAE化5血陰離子交換柱，先 用起始緩沖液平衡柱子，流速為5mL · mirTi，上樣后用洗脫緩沖液梯度洗脫蛋白，采用梯度 20% ,40% ,60% ,80%，100 % B液。合并活性管并透析除鹽。
[0042] (4)疏水層析
[0043] 起始緩沖液C:20mmol · L-ipH 7.0的憐酸鹽緩沖溶液。洗脫緩沖液D:含Imol · L-1 (NH4)2S化的20mmol · [ipH 7.0的憐酸鹽緩沖溶液。向蛋白樣品中緩慢加入固體硫酸錠至終 濃度為Imol -[1，經0.22μπι濾膜過濾，上樣于提前經的夜平衡的陸en^ HP 5血疏水柱，采用 梯度洗脫100%0,80%0,60%0,40%0,20%0，流速為51^*111111-1。分別測定收集各管酶活 性，合并活性管并透析除鹽。
[0044] (5)離子交換層析
[0045] 起始緩沖液E:20mmol · L-ipH 7.0的憐酸鹽緩沖溶液。洗脫緩沖液F:含Imol · L- iNaCl的20mmol?L-ipH 7.0的憐酸鹽緩沖溶液。經上步純化的蛋白上樣于Mono Q 5/50化離 子柱，采用線性洗脫方式，流速為ImL · mirfi。測定各管收集液酶活，合并有活性各管。
[0046] (6)凝膠過濾層析
[0047] S叩erdex-200 prep grade凝膠柱，進樣量為0.5mL，柱體積120mL，緩沖液為 20mmol · L-ipH 7.0的憐酸鹽緩沖溶液，流速ImL · min-i。收集出峰處，測定不同出峰處酶 活，合并有酶活各管，用于后續實驗。
[0048] 純化相關數據如表1所示（WEC酶酶活為測定依據），SDS-PAGE如圖2所示。
[0049] 表1:地衣芽抱桿菌化依賴性雙功能酸性脈酶純化過程相關參數
[(Κ)加 ]
[0051] 實施例3:地衣芽抱桿菌化3+依賴型食品級酸性脈酶應用于黃酒中EC及尿素的降解
[0052] 向煎酒前黃酒酒樣中分別添加500U/L終濃度的酶量，于37°C水浴反應，通過HPLC 檢測尿素降解量，通過GC-MS測定EC解降解量。結果如表2所示，由表2可W看出，本發明的脈 酶可有效降解黃酒中的尿素和EC(添加酶量為500U/L時，可消除黃酒中90%的尿素及27% 左右的EC)。
[0053] 表2:化依賴性雙功能酸性脈酶應用于降解黃酒中EC和尿素的結果 [0化4]
[0055]雖然本發明已W較佳實施例公開如上，但其并非用W限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該W權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種食品級酸性脲酶在發酵食品中的應用，其特征在于，所述應用是采用Fe3+依賴型 食品級酸性脲酶;所述酸性脲酶含有以下特征之一： (1) 結構亞基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID NO. 4所示； (2) 結構亞基的氨基酸序列是在（1)中氨基酸序列的基礎上經過取代、缺失或者添加一 個或幾個氨基酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由（1)衍生的蛋白 質； (3) 具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述Fe3+依賴型食品級酸性脲酶是Fe3+依賴 型脲酶，Fe 3+存在時表達的酶具有尿素和氨基甲酸乙酯降解酶活力。3. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述應用，是用于降低或消除發酵食品中 的尿素和/或氨基甲酸乙酯。4. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述發酵食品包括酒精類飲料、醬油。5. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述發酵食品為黃酒。6. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述Fe3+依賴型食品級酸性脲酶來源于 Bacillus licheniformis 9945A〇7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述生產菌株在發酵生產過程中添加 Fe3+。8. -種發酵生產酸性脲酶的方法，其特征在于，所述酸性脲酶為含有以下特征之一： (1) 結構亞基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID NO. 4所示； (2) 結構亞基的氨基酸序列是在（1)中氨基酸序列的基礎上經過取代、缺失或者添加一 個或幾個氨基酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由（1)衍生的蛋白 質； (3) 具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列； 所述方法，是在生產菌株發酵生產的過程中添加 Fe3+。9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述生產菌株為食品級生產菌株。10. 根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述生產菌株為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢 桿菌或者乳酸菌。
【文檔編號】A23L27/50GK106011118SQ201610397813
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月7日
【發明人】康振, 陳堅, 堵國成, 劉慶濤
【申請人】江南大學