專利名稱：較重鹵原子取代的斯夸苷基染料,其制備方法及其在光動力的治療和工業應用中作為敏 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及如下面分子式1的較重鹵原子取代斯夸苷(squaraine)基染料及其藥學可接受的衍生物， 分子式1其中X是較重鹵原子，它們能被用于光動力的治療和工業應用。本發明還涉及一種較重鹵原子取代斯夸苷基染料的制備方法及這種染料在光動力的治療和工業應用中作為敏化劑的用途。
本發明還涉及如分子式1的斯夸苷染料，其中X是溴或碘，或其藥學可接受的衍生物，它們可以在診斷和治療人或動物的癌及其它疾病的光動力應用中被用作光敏劑。
本發明還涉及其中X是重鹵原子的如分子式1的斯夸苷染料或其衍生物，它們可被用作水消毒的光動力工業應用中的光敏劑。
光動力治療是用于癌癥和多種疾病的診斷和治療的最新方式。大量證據提示光動力治療代表一種用于許多癌癥的方便有效的方法。光動力治療包括通過光和化學藥品(光敏劑)的聯合作用使活細胞失活。在靜脈注射后，光敏劑被腫瘤細胞選擇性地保留。腫瘤組織中比正常組織中有更多的敏化劑。當用特定波長的光或激光照射時，敏化劑產生高反應性物種，這些高反應性物種改變生物組織而引起癌細胞的選擇性破壞。
唯一已經過廣泛研究的敏化劑是光敏鈉，一種血卟啉衍生物(HpD)，也稱為第一代光敏劑。光敏鈉和其商業變體Photosan、發光菌是首先被許可臨床使用并首先獲得管理批準的。可是，光敏鈉的缺點是它是一種組份對所采用的合成方法高度敏感的混合物產品。已知會引起皮膚光敏性的不希望的副作用，因為它自身體緩釋。在這些情況下，用光敏鈉治療的病人需要長時間呆在黑暗中直到它從身體內排泄完。光敏鈉在光譜的紅區僅有微弱的吸收(在630nm的摩爾吸收系數為3000 M-1cm-1)，導致難于將光傳送到某些腫瘤位置以及大腫瘤光穿透的不完全。因此，利用光敏鈉的光動力治療僅顯示在小于10mm深度的表層的癌。可以參考Dougherty，T.J.Photochem.Photobiol.1987，45，879；Kessel，D.；Dougherry，T.J.PhorphyrinPhotosensitization；Plenum Publishing Corp.；New York，1983；Brown，S.B.；Truscott，T.G.Chem.Ber，1993，29，955；Andreoni，A.；Cubeddu，R.Phorphyrins in Tumor Phototherapy；Plenum Publishing Corp.NewYork，1984；Brasseur，N.；Hasarat，A.；Langlois，R.；Wagner，J.R.；Roussean，J.；van Lier J.E.Photochem.Photobiol.1987，45，581；Spikes，J.D.，Photochem.Photobiol.1986，43，691；Firey，P.A.；Ford，W.E.；Sounik，J.R.；Kenney，M.E，；Rodgers，M.A.J.J.Am.Chem.Soc.1988，110，7626；Moan，J.Cancer Lett.1986，33，45；Tralau，C.J.；Young，A.R.；Walker，N.P.J.；Vernon，D.I.；MacRobert，A.J.；Brown，S.B.；Brown，S.G.Photochem.Photobiol.1989，49，305。
為了克服第一代敏化劑的缺點，合成了在長波長區表現出強吸收的第二代敏化劑。正在光動力治療的不同臨床階段進行評價的第二代敏化劑包括二氫卟吩類、porphycenes、苯并卟啉類、酞菁類、紅紫素類和氨基乙酰基丙酸介導的卟啉類。紅紫素類具有良好的光學性質和生物分布型，但是需要加溶劑和乳化劑如脂質體或脂蛋白用于其光動力應用。二氫卟吩類在光譜的紅區和紅外區有強吸收并與光敏鈉競爭，但皮膚光敏性是它們的主要問題。已經發現酞菁和金屬酞箐類在600-700nm區有強吸收，但是磺化程度對光動力活性的細節是不清楚的。可以參見美國專利第603267、5965598、5889181、586035和5789586號；Kostenich，G.A.；Zuravkin，I.N.；Zhavrid，E.A.J.Photochem.Photobiol.B.Biol.1994，22，211；Leach，M，W.；Higgins，R.J.；Autry，S.A.；Boggan，J.E.；Lee，S.-J.H.；Smith，K.M.Photochem.Photobiol.，Bai，S.；Lin，C.；Guo，Z.Proc.SPIE 1993，1616，275；Vogel，E.；Kocher，M.Schmickler，H.；Lex，J.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1986，25，197；Leunig，M.；Richert，C.；Gamarra，F.；Lumper，W.；Vogel，E.；Jochani D.；Goetz，A.E.Br.J.Cancer 1993，68，225；Boyle，R.W.；Legnoff，C.C.；Vanheir，J.E.Br.J.Cancer 1993，67，1177；Wohrl，D.；Shopova，M.；Muller，S.；Muleiv，A.D.；Mantereva，V.N.；Krastev，K.K.J.Photochem.Photobiol.B.Biol.1993，21，155；Morgan，A.R.；Garbo，G.M.；Keck，R.W.；Ericksen，L.D.；Selman，S.H.Photochem.Photobiol.1990，51，589。
仍期望開發這樣的光敏劑，它在長波長區有強吸收，對正常組織無毒，在生理pH時溶于緩沖液，能夠在光動力治療期間被漂白，并顯示出更高的治療效果。
斯夸苷形成一類染料，在紅至接近紅外區具有尖銳并且強的吸收帶。這些染料的摩爾吸收系數通常在500,000M-1CM-1范圍內。斯夸苷在靜電復印光感受器、太陽能電池和光學記錄裝置中有工業應用。然而，由于這些染料非常低的系間竄越效率，它們作為光動力治療應用中的光敏劑的潛力還沒有研究。可以參考美國專利第6001523、5552253、5444463號；Law，K.-Y.Chem.Rev.1993，93，449；Piechowski，A.P；Bird，G.R；Morel，D.L；Stogryn，E.L.J.Phy.Chem.1984，88，934。
因此，研究斯夸苷基染料以觀察與先前技術有關的問題是否可以被克服。本發明的一個目的是提供一種光敏劑，基于斯夸苷部分，它適用于光動力治療應用。我們的初步研究表明當與母體未取代斯夸苷染料相比時，斯夸苷部分的鹵化作用導致增大的水溶性和系間竄越效率。這些鹵化染料在近紅外區(＞600nm)表現出強吸收和在微觀不均一性介質中顯著的紅移。三重激發態是包含在這些系統中的主要過渡態，它與分子氧有效地相互作用以定量的收率產生生物學高反應性的單線態氧，由此使它們成為光治療應用中潛在的候選者。可以參考Ramaiah，D.；Joy，A.；Chandrasekhar，N；Eldho，N.V.；Das，S.；George，M.V.Photochem.Photobiol.1997，65，783。
可是，這些鹵化斯夸苷染料的收率在規定的條件下較低，并且在膜模型和藥物載體系統如聚合物中其單線態氧(胞毒劑)的產生效率是未知的。而且，在文獻中對斯夸苷基染料的生物學性質或光動力治療應用尚無報道。對于確定敏化劑在光動力治療應用中的用途是重要的生物學性質包括敏化劑在生理pH和照射條件下的穩定性、細胞毒性、藥理學方面、生殖毒性和它的體內光動力活性的效率等。
本發明試圖克服上述限制。在本發明中通過修改加工條件，我們得到了收率增加的較重鹵原子改性的斯夸苷基染料。我們首次研究了典型的斯夸苷基光敏劑的生物學性質。這些研究包括這些敏化劑在生理pH條件下的穩定性、細胞毒性和在黑暗中和照射條件下的誘變性。另外研究了這些敏化劑的光動力作用的體內和體外效率和機理。
本發明的主要目的是提供有效的斯夸苷基染料和/或其藥學可接受的衍生物，它們能夠在光動力治療應用包括癌癥的治療中用作敏化劑。
本發明的另一個目的是提供斯夸苷基染料和/或其藥學衍生物，由于它們在微觀不均一性介質中的高熒光量子產率，它們能被用作診斷癌的熒光傳感器。
本發明的又一目的是提供斯夸苷基染料和/或其衍生物，它們能夠用于光動力工業應用如水的消毒等。
本發明的再一目的是通過在化學裝置中連接或引入斯夸苷基染料，能夠實現使這種藥物傳遞或靶向于確定的活細胞的生物學專一性，由此有效的第三代光敏劑也能夠開發出來。
在說明書附圖中
圖1表示在有光和無光情況下，如分子式1的斯夸苷染料的細胞殺傷效率的曲線圖。圖2表示在有光和無光情況下，通過雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的突變種誘導的曲線圖。圖3表示在有光和無光情況下，通過雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的突變種誘導的曲線圖。圖4表示在有光和無光情況下，通過雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的微核誘導的曲線圖。圖5表示在有光和無光情況下，通過雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的微核誘導的曲線圖。
因此，本發明涉及一種如分子式1的較重鹵原子取代斯夸苷染料和其藥學可接受的衍生物，其中X是較重鹵原子。 分子式1在本發明的一個實施方案中，X選自溴或碘。
在本發明的另一實施方案中，如分子式1的化合物是雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷。
在本發明的另一實施方案中，如分子式1的化合物是雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷。
本發明還涉及如分子式1的較重鹵原子取代的斯夸苷染料或其藥學可接受的衍生物的制備方法，其中X是較重鹵原子， 分子式1包括雙(2，4，6三羥基苯基)斯夸苷與鹵素溶液或鹵鹽在有機酸中，在50-80℃的溫度范圍內，在攪拌下反應1-5小時，冷卻上述反應混合物，過濾并洗滌所得化合物，接著重結晶得到所需化合物。
在本發明的一個實施方案中，鹵鹽是一氯化鹵。
在本發明的另一實施方案中，有機酸是冰醋酸。
在本發明的又一實施方案中，在過濾和洗滌步驟之前將水加入反應混合物中。
在本發明的再一實施方案中，鹵原子選自溴和碘。
本發明還涉及如分子式1的化合物在光動力治療應用中作為光敏劑的用途。
在本發明的另一個實施方案中，如分子式1的化合物用作腫瘤的熒光檢測劑并用在癌及其它有關疾病的光動力治療中。
本發明還涉及如分子式1的化合物在水消毒中作為敏化劑的用途。
本發明也涉及如分子式1的化合物在通過將其引入化學裝置使這種藥物靶向于確定的活細胞來設計有效的第三代光敏劑中的用途。
在如分子式1的化合物的制備中，雙(2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的芳環用較重鹵原子如溴改性以得到雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和用碘改性以得到雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷。
觀察到具有斯夸苷部分的結構式為雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的化合物及其藥學衍生物在生理pH條件下具有良好的溶解性和表現出很好地進入光動力窗的強吸收(＞600nm)。這些染料在黑暗中是非常穩定且無毒的，并且當暴露于光時表現出良好的細胞殺傷效率。它們進行快速的光漂白并且它們的光降解產物在有光和無光的情況下是無毒的。它們不誘導顯著的突變。由于上述斯夸苷基染料具有良好的光物理和生物學性質，這些化合物非常適合作為光敏劑用于光動力治療和工業應用。
下面的實施例是說明性，因此，它們不應被認為是限制本發明范圍的。實施例1雙(2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷(Triebs，A；Jacob，K.Angew，Chem.Int.Ed.Engl.1965，4，694)通過在50-60℃攪拌溶液1-3h溶解在冰醋酸中(1∶4.7×103)中。溶液冷卻后，溴的醋酸溶液(1∶1.7×102)在1-2h內被逐滴加入，反應混合物在50-60℃加熱1-2h，然后在冰箱中保存10-12h。將形成的沉淀物過濾并用75-100ml水洗滌。然后，從水與異丙醇(3∶1)的混合物中重結晶得到75-85％的雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷。
雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的生化性質熔點314-315℃，IR(KBr)νmax3413，1622，726和519cm-1；分子量計算的642.6874；測定的642.6879(HRMS)；UV[20％v/v甲醇-水]λmax610nm(ε47000M-1cm-1)；[甲醇]λmax612nm(ε210000M-1cm-1)；性狀深藍色粉末。實施例2雙(2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷(Triebs，A；Jacob，K.Angew，Chem.Int.Ed.Engl.1965，4，694)通過在60℃-70℃攪拌溶液1-2h溶解在冰醋酸(1∶4.7×103)中。冷卻后，冰醋酸中的一氯化碘(1∶1.7×102)在1-2h內被逐滴加入。將反應混合物在50-60℃加熱1-2h，把15ml的水加入其中，并在冰箱中保存10-12h。將形成的沉淀物過濾，用水(75-100ml)洗滌，并從甲醇與異丙醇(3∶1)的混合物中重結晶得到65-75％的雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷。
雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的生化性質熔點270-271℃；IR(KBr)νmax3383，1603，726和568cm-1；分子量計算的834.6320；測定的834.8360(HRMS)；UV[20％v/v甲醇-水]λmax617nm(ε63000M-1cm-1)，[甲醇]λmax620nm(ε249000M-1cm-1)；性狀深藍色粉末。實施例3由于三線激發態是雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷從532nm激光閃爍光分解研究得到的主要瞬時中間產物，所以，測定了由這些系統產生光敏單線態氧的效率，因為單線態氧是在光動力治療中II型反應的主要胞毒劑。由于雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的單脫質子化形式有大的三線態收率并有長的壽命(Ramaaiah.D.Joy，A；Chandrasekhar，N；Eldho，N.V；Das，S；George，M.V.Photochem.Photobiol.1997，65，783)，而且這些是所期望在生理pH條件(約7.4)下的主要種類的形式。這些染料在光動力治療中用作敏化劑的一級特征，我們研究了在藥物載體、膜模擬物和微觀不均一性介質存在下，它們的單線態氧產生效率。在聚乙烯吡咯烷酮(PVP)存在下，使用雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷所得的結果列于表1中。
表1列出了在存在和不存在聚乙烯吡咯烷酮的情況下雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的單線態氧產生效率。
表1化合物PVP，mM單線態氧量子產率雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷 0 0.13±0.00514 0.29±0.001雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷 0 0.47±0.01714 0.62±0.007該結果顯示在由雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷兩者敏化的情況中，在PVP存在下，單線態氧的量子產率均顯著增加。在雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的情況中，單線態氧的產生效率在微觀不均一性介質中比在甲醇中多近15％。另外，這些研究指出較重鹵原子取代斯夸苷染料能作為光動力治療應用中有效的光敏劑。實施例4通過使用質粒DNA(PM2 DNA)和研究在各種條件下的DNA裂解，對斯夸苷體的外光動力活性的機理進行了詳細的評估。DNA裂解之后，調控超螺旋(形式I)轉變到開環(形式II)和直線形式(形式III)。通過化合物/劑的一種單股斷裂的誘導使形式I轉變為形式II，以及通過如以前文獻(Epe，B.；Hegler，J.J.Methods Enzymol.1994，234，122)所述的DNA弛豫分析對這些形式的定量，表明了它的DNA裂解效率。質粒DNA裂解是非常靈敏的技術，它可以被用于測試敏化劑的各種性質以及通過使用清除劑和活化劑得到的DNA損傷分布型，能用作對損傷有直接責任的物種的一種指紋圖譜并且也提供體外光動力活性機理的信息。
在冰上的磷酸鹽緩沖液(5mM KH2PO4，50mM NaCl，pH7.4)中的PM2 DNA(10,000bp，10μg/ml)被暴露于斯夸苷染料外加來自距離33cm的1000W鹵燈(Philips，PF811)的光線下。改性DNA通過乙醇/乙酸鈉沉淀和通過DNA弛豫分析定量單股斷裂(SSB)。將超氧物歧化酶(SOD)(20μg/m)、過氧化氫酶(315U/ml)加入或用D2O取代緩沖液中的H2O(最終的同位素純度大于96％)以便對包含的活性物質有更好的了解。對典型的斯夸苷基染料雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的這些研究結果列于表2中。
表2列出了在有和沒有添加劑的情況下，通過雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷使質粒DNA裂解的效率。
表2所列的結果指出，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶對雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷誘導的DNA裂解效率都沒有顯著影響。因此，在磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中沒有添加劑的情況下觀察到的過氧化物和過氧化氫(單股斷裂(SSB)的可能數量定為100％。
表2在下列條件下單股斷裂的相對數量(％)化合物pH7.0 pH7.8D2O SOD 過氧化氫酶緩沖液 (20g/mL)(315U/mL)雙(3，5-二溴- 127±12 105±4 526±28 109±5 115±52，4，6-三羥基苯基)斯夸苷雙(3，5-二碘- 134±9109±22 614±97 100±2 92±62，4，6-三羥基苯基)斯夸苷這些物種后來的芬頓(Fenton)反應不包括在DNA裂解中。在D2O中雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷誘導的DNA裂解近5和6倍的增強有力地表明，在這些情況中體外的光動力活性是由單線態氧介導的。實施例5在有光和無光的情況中敏化劑的穩定性信息對于它的實際使用是重要的。因此，通過利用分光光度法測定吸光度變化研究了在有光和無光情況下，在乙醇和磷酸鹽緩沖液中，在生理pH條件(pH7.4)下，在25℃時這些染料的穩定性。典型的斯夸苷基染料雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷在黑暗中相對時間的吸光度變化結果列于表3中。
表3列出了雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷在乙醇和緩沖液(pH7.4)中，在黑暗中的穩定性。
表3在黑暗 吸光度中的時 雙(3，5-二溴-2，4，6-雙(3，5-二溴-2，4，6- 雙(3，5-二碘-2，4，6-間，min 三羥基苯基)斯夸苷 三羥基苯基)斯夸苷 三羥基苯基)斯夸苷(乙醇)(緩沖液) (緩沖液)0 1.90 1.84 1.7530 1.88 1.72 1.4760 1.88 1.65 1.3890 1.88 1.61 1.36在黑暗中的結果顯示染料雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷在乙醇中非常穩定，但超過90min，在pH7.4緩沖溶液中受到輕微的漂白。雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷在pH7.4緩沖溶液中，在照射條件下所得的結果列于表4中。
表4列出了雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷在緩沖液(pH7.4)中，在照射條件下的穩定性。
表4在黑暗中的時吸光度間，min雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基苯基)斯夸苷基)斯夸苷0 1.8 1.7251.35 0.87101.30 0.74151.25 0.65201.17 0.58301.10 0.47在照射條件下(1000W鹵燈(Philips，PF811)，距離33cm)的結果顯示，這些染料表現出顯著的光漂白。與雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷(25％)比較，化合物雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷受到很迅速的光漂白(在照射5min內近50％)，在兩種情況中光漂白均隨照射時間的增長而增加。盡管光漂白可能被認為是在腫瘤光敏劑中不利的性質，但由于可以調節劑量到保持腫瘤中的光敏劑在有效水平，它具有潛在的益處。另外，因為它們的快速光漂白，光動力治療后的病人不需要長時間呆在黑暗中，并且如果需要，治療可以短時間間隔頻繁地重復。實施例6為了測定有光與無光時斯夸苷基敏化劑的細胞殺傷效率(細胞毒性)，將AS52細胞暴露在各種濃度的敏化劑下，暴露于光是用1000W鹵燈，距離33cm，在無Ca2+和Mg2+的PBS(140mM NaCl，3mMKCl，8mM Na2HPO4，pH7.4)中在冰上(106細胞/ml)進行的。照明10min相當于在400和800nm之間的225kJ/m2。細胞通過離心成團并在PBSG中重懸浮三次。細胞在新制介質中以3×104細胞/ml在37℃重懸浮，且細胞數被重復計數60小時。由生長曲線的指數部分(在24和60h之間)，在重懸浮時增殖的細胞數通過外推法計算。細胞存活率定義為增殖與重懸浮細胞之比。用典型的斯夸苷基染料雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷得到的結果示于圖1中。
該結果顯示，在照明條件下，細胞存活率的百分數隨雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷的濃度增加而降低，表明它們在這些條件下的高細胞殺傷效率。同時，雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷在黑暗中沒有表現出顯著的效果，由此表明了它們在無光情況下的無毒性。這些結果清楚地證明了較重鹵原子取代斯夸苷染料的光動力治療應用。實施例7斯夸苷基敏化劑的誘變特性是在AS52細胞中測定的，該AS52細胞攜帶有細菌的鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶(gpt)基因作為賦與對6-硫代鳥嘌呤的敏感性的選擇標記。AS52細胞在含有11μg/ml黃嘌呤219μg/ml黃嘌呤、22μg/ml腺嘌呤、1.2μg/ml氨蝶呤和8.8μg/ml霉酚酸的清潔介質中培養一星期，以消除自發gpt突變種。細胞(0.5×106)在回收介質(含1.2μg/ml胸腺嘧啶脫氧核苷、11.5μg/ml黃嘌呤、3μg/ml腺嘌呤)中培養48h，然后，如上所述在有光和無光的情況下，暴露于雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷中，之后培養一星期(表達時間)。在此時間內，保持細胞指數增長。2×105個細胞被稀釋在10ml培養介質中和被平鋪在皮氏培養皿(94mm)中。2小時后，將6-硫代鳥嘌呤加入到各平皿(終濃度2.5μg/ml)中以選擇。將200個細胞加入到5ml培養介質平鋪在皮氏培養皿(60mm)中以確定克隆效率。將平皿保溫7至9天。用Nacl溶液(0.9％v/v)代替介質。細胞群用甲醇(-20℃)固定15min并用吉姆薩(Giemsa)(10％在H2O中)染色15min。暴露于斯夸苷外加光線后接下來的抗6-硫代鳥嘌呤細胞的定量和細胞毒性的確定(處理和未處理的細胞的平皿培養效率之比)，根據文獻(Tindall，K.R；Stankowski Jr.L.F.；Machanoff，R.；Hsie，A.W.Mutat Res.1986，160，121-131)進行。
所得結果示于圖2和圖3中，它們表明在有光和無光情況下雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷不誘導立即的突變。雖然在有光的情況發現有嚴重的細胞毒性，但當與黑暗和控制值比較時，未發現自發突變頻率的顯著增加。實施例8為進一步了解遺傳效果，由雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷誘導的微核也在AS52細胞中定量。AS52細胞被如上所述地暴露于斯夸苷中及在全部介質中重懸浮。在39℃培養24小時后，約1×105個細胞通過細胞旋轉離心法和用甲醇在-21℃處理1小時被固定在顯微鏡的載玻片上。在PBS(無Ca2+和Mg2+)中用二苯并二酰亞胺(bisbenzimide)染色3min后，用熒光顯微鏡檢測了2000個細胞的微核存在。所得結果示于圖4和圖5中，它們表明這些染料沒有誘導大量的微核。
本發明的斯夸苷基染料具有用于光動力的治療和工業應用中的光敏劑的令人滿意的性質。這些系統的主要優點包括1.以雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷結構為代表的斯夸苷基敏化劑是純的單一物質。
2.它們的合成工藝是經濟的。
3.它們在黑暗中十分穩定并且在膜模型和載體系統存在時其穩定性增加。
4.它們在生理pH條件下的緩沖液中有非常好的溶解性，因此，藥物制劑能夠通過本身的傳統工藝來制備并避免使用添加劑和載體。
5.它們具有良好的吸收性質(＞600nm)及很大的吸收系數，(約100,000M-1cm-1)6.它們具有好的長壽命的三線態收率并且在膜模型和載體系統中以定量收率產生單線態氧。
7.它們在黑暗中無毒而且當暴露于光時顯示出良好的細胞殺傷作用，如所希望的理想的光敏劑一樣。
8.它們受到快速的光漂白，因此，光動力治療后的病人不需要長時間呆在黑暗中，并且如果需要，治療可以短時間間隔頻繁地重復。
9.在有光和無光情況下，它們的光降解副產物是無毒的。
10.這些染料的光動力活性在暴露于光下5min內是最大的，因此，用于治療需要非常短的照射時間間隔。
11.它們是非誘變的。
12.它們可以被有效地用于靶向于確定的細胞器的第三代光敏劑的合成。
權利要求
1.一種如分子式1的較重鹵原子取代斯夸苷染料及其藥學可接受的衍生物， 分子式1其中X是較重鹵原子。
2.如權利要求1所述的染料，其中X選自溴或碘，且分別以雙(3，5-二溴-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷和雙(3，5-二碘-2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷為代表。
3.一種如分子式1的較重鹵原子取代斯夸苷染料或其藥學可接受的衍生物的制備方法，其中X是較重鹵原子， 分子式1該方法包括雙(2，4，6-三羥基苯基)斯夸苷與鹵素溶液或鹵鹽在有機酸中，在50-80℃的溫度范圍內，在攪拌下反應1-5小時，冷卻以上反應混合物，過濾并洗滌所得化合物，接著通過重結晶得到所需化合物。
4.如權利要求3所述的方法，其中的鹵鹽是一氯化鹵。
5.如權利要求3所述的方法，其中的有機酸是冰醋酸。
6.如權利要求3所述的方法，其中在過濾和洗滌步驟前將水加入反應混合物中。
7.如權利要求3所述的方法，其中的鹵原子選自溴和碘。
8.如分子式1的化合物在光動力治療應用中作為光敏劑的用途。
9.如分子式1的化合物在癌和其它相關疾病的光動力治療中作為腫瘤熒光檢測劑的用途。
10.如分子式1的化合物在水消毒中作為敏化劑的用途。
11.如分子式1的化合物在通過將其引入化學裝置以使這樣的藥物靶向于確定的活細胞而設計有效的第三代光敏劑中的用途。
全文摘要
本發明涉及如下面分子式1的較重鹵原子取代斯夸苷基染料及其藥學可接受的衍生物,以及其制備方法,其中X是較重鹵原子,它們可被用于光動力的治療和工業應用中。
文檔編號C09B13/00GK1361205SQ0013729
公開日2002年7月31日 申請日期2000年12月29日 優先權日2000年12月29日
發明者拉邁亞·達納博伊納, 阿倫·泰扎特威蒂爾·卡利亞特, 蘇雷什·達斯, 貝恩德·埃佩 申請人:科學工業研究院