一種檢測內源性H2S的有機硅納米染料探針及其制備方法和應用與流程

本發明屬于生物化工領域，涉及可用于構建生物體內利用光聲來檢測內源性H₂S的新型有機硅納米染料探針，具體涉及一種檢測內源性H₂S的有機硅納米染料探針及其制備方法和應用。

背景技術：

氟化硼絡合二吡咯甲川類(Boron-dipyrromethene，簡稱BODIPY)熒光染料是一類性能優異的新型熒光分子染料，這類染料具有很高的摩爾消光系數，能夠提高染料光敏性能。具有較高的熒光量子產率。其光譜性質相當穩定，不易受溶劑極性和pH值的影響。可應用于生物分子標記，如DNA領域。其熒光光譜峰寬較小，這個優點使得染料在應用到分析領域的時候檢測靈敏度更高。具有較好的光熱穩定性和化學穩定性，避免受外界干擾而迅速光降解，保證了光信號的穩定。具有較小的分子質量與較低的細胞毒性。目前合成此類染料的研究工作仍存在不足，如水溶性差、檢測范圍比較局限大部分用于檢測外源性的小分子等。

分子探針用兩親性聚合物可以顯著改善分子的水溶性，用有機硅烷試劑包裹的納米分子探針形成的核殼結構比較穩定，可以顯著改善分子探針在水中的穩定性。光聲成像作為一種把激發光信號轉換為聲波信號的成像方式，相對于傳統光學成像技術，具有更深的組織穿透深度，更高的活體空間分辨等諸多優勢，因而在生物和醫學領域作為一種非侵入的成像工具得到了廣泛的應用。目前開發針對目標分子可激活型的光聲探針依然面臨很大的挑戰。

技術實現要素：

本發明第一個目的是提供一種檢測內源性H₂S的有機硅納米染料探針。

本發明第二個目的是提供一種檢測內源性H₂S的有機硅納米染料探針制備方法。

本發明第三個目的是提供一種檢測內源性H₂S的有機硅納米染料探針利用光聲分析手段在檢測活體中內源性硫化氫上的應用。

本發明的技術方案如下：

一種檢測內源性H₂S的有機硅納米染料探針，所述有機硅納米染料探針結構：小分子探針BODPA包裹于由mPEG-DSPE2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)形成的膠束的疏水內腔中，外層為由PEG親水長鏈和N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三正丁基溴化銨形成的硅殼；

所述化合物BODPA的結構式為：

R：Me(BODPA1)

：COOH(BODPA2)

進一步，所述有機硅納米染料探針內部為染料分子BODPA和PEG疏水內腔，外部為PEG親水長鏈與硅層。

更進一步，所述納米球的粒徑為0～100nm。

根據本發明所述檢測內源性H₂S的有機硅納米染料探針，所述檢測內源性H₂S的有機硅納米染料探針利用的是光聲的分析手段來檢測內源性硫化氫。

本發明還提供一種所述檢測內源性H₂S的有機硅納米染料探針，包括如下步驟：

BODIPY經過Vilsmeier-Haack醛基化反應后，再與吲哚鹽或者吲哚羧酸鹽縮合，在mPEG-DSPE和TBNBr中經自組裝，得到所述檢測內源性H₂S的有機硅納米染料探針。

本發明還提供一種所述檢測內源性H₂S的有機硅納米染料探針在檢測內源性H₂S的應用，特別是在檢測活體中內源性H₂S的應用。

本發明獨創性的利用BODIPY染料、兩親性聚合物和有機硅烷試劑，設計合成了一系列利用光聲分析手段檢測內源性H₂S的有機硅納米探針，克服了現有技術所存在的缺點和不足。

本發明是BODIPY經過Vilsmeier-Haack醛基化反應，與吲哚鹽或者吲哚羧酸鹽縮合，mPEG-DSPE,TBNBr自組裝等過程，得到可利用光聲分析手段檢測內源性H₂S小分子的有機硅納米探針Si@BODPA。如圖3所示。

本發明同現有技術相比，具有以下優點和有益效果：

本發明是利用mPEG-DSPE和TBNBr顯著提高分子探針的水溶性和穩定性，并且首次實現了利用光聲分析手段快速檢測體外和活體中的硫化氫。

本發明有益的技術效果：

本發明是利用mPEG-DSPE和TBNBr顯著提高分子探針的水溶性和穩定性及分子探針與硫化氫的反應速度，并且首次實現了光聲分析體外和活體中的硫化氫。

附圖說明

圖1為本發明合成的有機硅納米染料探針Si@BODPA結構及檢測內源性硫化氫的原理。Si@BODPA與NaSH反應，BODPA上Cl原子被-SH取代，紫外吸收發生紅移，到達近紅外區，產生光聲信號。

圖2為有機硅納米染料探針Si@BODPA結構示意圖。

圖3為合成有機硅納米染料探針Si@BODPA的路線圖。

圖4中A是有機硅納米染料探針Si@BODPA與硫化氫反應的紫外變化圖。反應后紫外吸收發生了紅移，到達近紅外區，從而可以產生光聲信號。

圖4中B是使用不同當量的硅烷試劑對探針與硫化氫反應速度的影響。硅烷試劑用量越多，探針和硫化氫反應的速度越快，當硅烷的用量是探針的180倍時，反應可以在15秒內反應完。

圖5為探針加入NaSH前后光聲信號的變化。加入硫化氫后探針產生的光聲信號是原來的44倍。

圖6為光聲探針Si@BODPA的選擇性效果圖。探針只會選擇性的和硫化氫反應，產生光聲信號而不會和其他活性氧，活性氮，活性硫反應，且半胱氨酸，高半胱氨酸和谷胱甘肽不會影響探針和硫化氫的反應。

圖7為光聲探針Si@BODPA在小鼠腫瘤部位原位注射與內源性硫化氫作用的效果圖。說明探針在活體腫瘤原位注射可以和內源性硫化氫反應產生光聲信號。

圖8為BODPA2的氫譜，用的氘代氯仿。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ1.05-1.09(t,J＝8Hz,3H),1.52(s,3H),1.78(s,6H),2.41(q,J＝8Hz,2H),2.71(s,3H),4.30(s,2H),7.29(s,1H),7.42-7.44(m,2H),7.49-7.56(m,4H),7.61-7.63(m,4H),8.01-8.05(d,J＝16Hz,1H).

圖9為BODPA2的碳譜，用的是氘代氯仿。¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ12.8,13.9,14.1,17.3,22.7,27.5,31.6,31.8,51.8,110.5,114.6,122.0,122.3,123.3,128.9,129.2,129.4,129.6,130.5,131.8,135.4,136.2,139.3,140.1,140.6,141.6,142.5,144.0,144.6,168.8,181.1.

圖10為BODPA2的質譜。HRMS:calculated for C₃₃H₃₂BClF₂N₃O₂[M-Br]⁺: 585.2280,found:585.2272.

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步闡述，本領域技術人員應當理解，所述實施例僅用于示例，而不對本發明構成任何限制。

術語：

實施例1化合物BODPA2的合成

N₂氣體保護下，在30ml絕對無水乙醇中加入A(386mg,1mmol)和B(298mg,1mmol；R＝COOH)回流五小時，冷卻，旋干溶劑，柱層析提純得到466mg黑色固體，產率70％。(A為本實驗室自制，自制方法參考專利號：ZL 201410766204.6，B為購買)

實施例2化合物Si@BODPAs的合成

BODPAs(0.3μmol)快速加入到溶解mPEG-DSPE(19.1mg)的3mL 0.85N稀鹽酸溶液中，超聲10分鐘，再加入一定量的TBNBr硅烷試劑，攪拌24小時，透析兩天，得到光聲探針溶液。

TBNBr分別稱5.73mg(TBNBr/mPEG-DSPE＝30/100,w/w),17.19mg(TBNBr/mPEG-DSPE＝90/100,w/w),34.38mg(TBNBr/mPEG-DSPE＝180/100,w/w)and 51.57mg(TBNBr/mPEG-DSPE＝270/100,w/w),得到Si@BODPA30,Si@BODPA90,Si@BODPA180and Si@BODPA270。